ADN ligasa

La unión de los fragmentos de Okazaki (son las cadenas complementarias originadas a partir de las cadenas molde) con las cadenas complementarias necesita una enzima que la catalice. Esta enzima es la ADN ligasa.

Su función es catalizar un enlace fosfodiéster entre el grupo 3'-hidroxilo extremo de una de las cadenas de ADN y el grupo 5'-difosfato del extremo de la otra cadena de ADN. Para llevar a cabo esta reacción, la célula necesita energía porque se trata de una reacción termodinámicamente desfavorable, es decir, no es una reacción que sucede de manera espontánea.

Por un lado, en las células eucariotas y en las arqueas, la fuente de energía es el ATP (Adenosin Trifosfato). La molécula de ATP se separa en AMP (Adenosin Monofosfato) y pirofosfato para facilitar la dirección.

Por otro lado, las bacterias obtienen la energía del NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) el cual se divide en AMP y NMN (mononucleótido de nicotinamida) con la misma finalidad que lo hace el ATP de eucariotas y arqueas.

La ADN ligasa no puede unir dos moléculas de ADN de cadena sencilla (ADN con una sola cadena) ni formar un ADN circular de cadena sencilla sino que su función es sellar las roturas que han tenido lugar en las moléculas de ADN de doble cadena (ADN con dos cadenas enrolladas en forma de doble hélice) en el momento de la separación de la doble hélice.

La bacteria escherichia coli es capaz de formar un enlace fosfodiéster si hay al menos algunas bases nitrogenadas de ADN de cadena sencilla con el extremo de un fragmento de ADN de doble cadena y formar pares de bases.

La ligasa codificada por el bacteriófago T4 puede unir dos fragmentos de doble hélice de extremos romos, esta capacidad se explota en la tecnología de ADN recombinante.

La manera más sencilla del ADN es aquella que tiene su extremo romo. Este tipo de moléculas terminan con un par de bases. Las moléculas con extremos romos tienen dos desventajas; la primera es que las cadenas con extremos romos tienen menos rendimiento y la segunda es que tiene más posibilidades de insertar el fragmento de ADN deseado en la dirección opuesta a la que se quiere. por otro lado, dos extremos romos siempre serán compatibles entre sí.

La enzima reacciona con ATP o NAD+ para formar una molécula de AMP ligada por un grupo fosfoamido con el grupo amino del sitio activo de la lisina.B. El fosfato 50 del ADN ataca el grupo fosforilo del AMP para formar ADN adenilado.C. La ADN ligasa cataliza la reacción entre el grupo OH del ADN y el fosfato 50 activado para formar un enlace fosfodiéster así liberando AMP.

Para formar los dos enlaces fosfodiéster covalentes entre ambos extremos de las dos cadenas, la ADN ligasa cataliza una reacción junto con el ATP que sigue 3 pasos:

1-Adenización de un residuo en el centro activo de la enzima liberando fosfato.

2- Transferencia del AMP hacia el fosfato 5 'del donante originando la formación de un enlace pirofosfato.

3-Formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato 5 'del donante y el hidroxilo 3' del aceptor.

Cuando la ligasa trabaja sobre extremos rotos requiere mayor concentración de enzimas y diferentes condiciones de reacción.

En 1967, científicos de varios laboratorios descubren la ADN ligasa. Se descubrieron originalmente en el bacteriófago T4, la bacteria escherichia coli, así como en otras bacterias.

Existen dos ramas principales de ADN ligasas: las ADN ligasas ATP-dependientes y las NAD+-dependientes. El cofactor ATP es principal en las células de mamíferos mientras que las bacterias utilizan principalmente el NAD+ como cofactor de la enzima, aunque se encuentran bacterias con la capacidad de formar enzimas que necesitan de ATP como cofactor para funcionar. No obstante ambas enzimas siguen el mismo mecanismo reactivo.

La ADN ligasa de la bacteria E.coli está codificada por el gen LIG. Como en muchos organismos procariotas, la ADN ligasa de esta bacteria usa la energía creada con el cofactor NAD para formar los enlaces fosfodiéster. Esta ligasa no puede unir los extremos romos de ADN excepto en ciertas condiciones moleculares de importante presencia de glicol polietileno. Tampoco puede unir de manera eficiente el ARN al ADN. Esta enzima se utiliza en laboratorios para clonar moléculas de ADN de virus dsDNa.

En los mamíferos, se pueden determinar hasta 4 clases de ADN ligasas cuyo substrato principal es ATP. Tres genes identificados codifican estas ADN ligasas: LIG1, LIG3 y LIG4. La ADN ligasa II al ser un derivado de la ADN ligasa III (por mecanismo proteolítico) reduce a 3 genes el número de genes implicados en la biogénesis de estas enzimas. El rol que desempeñan cada una de estas enzimas viene determinado por las proteínas con las que interacciona.

Actualmente las ADN ligasas son una herramienta indispensable en la investigación, en el sector de la biología molecular, que se usa para generar secuencias de ADN recombinante.

Principalmente son usadas como enzimas de restricción para insertar fragmentos de ADN casi siempre en genes de moléculas de ADN plasmídico aunque también se puede insertar en otros.

Para realizar este tipo de experimentos se debe controlar sobre todo la temperatura. Como la mayoría de experimentos usan las ADN ligasa de T4, se realizan a una temperatura de 25 °C debido a que es la temperatura en la que la actividad enzimática de estas proteínas es mayor. Esta temperatura debe equilibrarse con la temperatura óptima de fusión para que ambas cadenas se unan. La temperatura de ligadura más eficaz para los extremos romos es de 14-20 °C.

Para la clonación de las cadenas de ADN se utilizan vectores plasmídicos, pequeñas moléculas circulares de doble cadena, derivados de grandes plásmidos (moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientemente del ADN cromosómico) que aparecen de forma natural en casi todas las bacterias y ciertos levaduras. Como norma general suponen un pequeño fragmento del ADN total de la célula del huésped pero se pueden separar debido a su pequeño tamaño con respecto a las moléculas de ADN cromosómico de tamaño superior y que sedimentan por centrifugación.

Para poder utilizar los plásmidos circulares como vectores de clonación, el primer paso es purificarlos. Una vez se han purificados estos vectores de clonación se cortan con una nucleasa de restricción (estas nucleasas son enzimas que cortan el ADN de doble cadena cuando éstas reconocen un patrón de secuencia específico) para generar moléculas lineales. Por su parte el ADN genómico de la célula que se va a utilizar en la construcción de la genoteca es cortado con la misma nucleasa de restricción; los fragmentos de restricción resultantes (entre los que se encuentran los que contienen el ADN que va a ser clonado) se añaden a los plásmidos cortados y se cierran, formando moléculas circulares de ADN recombinante. Estas moléculas recombinantes, que contienen injertos de ADN ajeno, se unen covalentemente mediante la enzima ADN ligasa.

El siguiente paso en la preparación de la genoteca consiste en introducir las moléculas circulares de ADN recombinante en bacterias temporalmente permeables al ADN; se dice que estas células han sido transfectadas con el plásmido. A medida que estas células van creciendo y dividiéndose - duplican su número cada 30 minutos- los plásmidos recombinantes también se van replicando y produciendo un número enorme de copias de ADN circulantes que contienen ADN ajeno.

Inserción de un fragmento de ADN en un plásmido bacteriano mediante la enzima ADN ligasa. El plásmido se abre realizando un corte con una nucleasa de restricción (en este caso una que produce extremos cohesivos) y se mezcla con el ADN ligasa, ATP y el fragmento de ADN que se desea clocar (el cual ha estado preparado con la misma nucleasa de restricción). Los extremos cohesivos se aparean entre sí y la ADN ligasa sella los cortes de la cadena de ADN, produciendo una molécula de ADN completa

El complejo IV ligasa de ADN, que consiste en el ADN de la subunidad catalítica de ligasa IV y XRCC4 su cofactor, lleva a cabo la etapa de ligación de la reparación. XLF, también conocido como Cernunnos, es homóloga a la levadura Nej1 y también se requiere para NHEJ(“No Homologue Extreme junction" o “Extremo no homólogas de unión” es un camino que repara roturas de doble cadena en el ADN. NHEJ se conoce como "no homóloga" porque los extremos rotura se ligan directamente sin la necesidad de una plantilla homóloga, en contraste con la recombinación homóloga, lo que requiere una secuencia homóloga a la guía de reparación). Mientras que el papel preciso de XLF es desconocido, que interactúa con el complejo IV XRCC4/ADN ligasa y es probable que participa en la etapa de ligación. La evidencia reciente sugiere que XLF re-adenilatos ADN ligasa IV después de la ligadura, la recarga de la ligasa y permitiendo que catalizan una segunda ligadura.

La ADN ligasa IV y XLF se requieren para todos los eventos NHEJ.

Muchos genes NHEJ se han eliminado en los ratones. Supresión de la XRCC4 o LIG4 causas letalidad embrionaria en ratones, lo que indica que NHEJ es esencial para la viabilidad en los mamíferos. Todos los ratones NHEJ mutantes muestran un fenotipo SCID, la sensibilidad a la radiación ionizante, y la apoptosis neuronal.

La disfunción parcial de la ADN ligasa está relacionada también con Síndrome con Inestabilidad cromosómica.

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