Método de Sanger

En 1977, Frederick Sanger desarrolló el método de secuenciación de ADN conocido como método de Sanger. Dos años más tarde empleó esta técnica para secuenciar el genoma del bacteriófago Phi-X174, el primer ácido nucleico secuenciado totalmente en la historia. este trabajo manualmente, sin ayuda de ningún automatismo. Este trabajo fue base fundamental para proyectos tan ambiciosos como el Proyecto Genoma Humano, y por él se le concedió su segundo Premio Nobel en 1980, que compartió con Walter Gilbert.

El método de secuenciación por didesoxinucleótidos, más conocido como el método Sanger se basa en el proceso biológico de la replicación del ADN. El método de secuenciación ideado por Sanger se basa en el empleo de dideoxinucleótidos que carecen del grupo hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongándose. Esto sucede porque la ADN polimerasa necesita un grupo terminal 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo.

El método comienza una vez que se aísla y se clona el ADN que se desea secuenciar. Este DNA se desnaturaliza y se emplea una sola hebra para la secuenciación. En la secuenciación se utiliza un cebador (denominado “primer” en inglés), que se encarga de suministrar el terminal 3’OH que necesita la ADN polimerasa para comenzar a elongar. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el ADN molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, con ADN polimerasa, con el “primer” y con los cuatro nucleótidos trifosfatados.

A cada tubo se le añade una pequeña proporción de un dideoxinucleótido trifosfato; un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de estos tubos se producen cadenas de ADN de distintas longitudes, todas las cuales terminan en el lugar en el que se incorporó el dideoxinucleótido correspondiente añadido al tubo. Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, se cargan en un gel de acrilamida y se someten a electroforesis. Así obtendremos un patrón de bandas en orden, del cual es posible deducir la secuencia del ADN introducido.