Recombinaison homologue

À la suite de la formation d'une cassure double brin de l'ADN, la recombinaison homologue est initiée par la dégradation, de part et d'autre de la cassure, du brin d'ADN orienté dans le sens 5'-3'. Cette étape, dite de résection, expose un ADN simple brin dont l'extrémité est orientée 3', qui pourra par la suite être utilisée comme amorce par des ADN polymérases. Chez les eucaryotes la résection a lieu en deux temps: un mécanisme de faible portée initié par le clivage à quelques dizaines de nucléotides de la cassure initiale par le complexe MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) et CtIP chez l'humain. Un mécanisme de longue portée conféré par une exonucléase (EXO1) et un couple hélicase-endonucléase (BLM-DNA2) qui expose de l'ADN simple brin sur plusieurs kilobases[5].

La protéine centrale de la voie de recombinaison homologue est Rad51/RAD51 chez les eucaryotes (RecA chez les procaryotes), assemblée en un filament nucléoprotéique sur l'ADN simple brin généré par la résection. Son assemblage implique un remplacement de RPA, une protéine abondante à haute affinité pour l'ADN qui lie en premier lieu l'ADN simple brin généré par la résection. Ce remplacement est catalysé par des médiateurs, tels que la protéine BRCA2 chez l'homme[6]. D'autres protéines s'associent au filament pour assurer sa stabilité et sa fonction, tels que les paralogues de RAD51 et la translocase RAD54. Chaque monomère de RAD51 lie un triplet de nucléotides qui conserve sa conformation initiale (i.e. ADN B). Chaque triplet se trouve séparé du suivant par un étirement du squelette phosphate entre les monomères de RAD51, conduisant à une extension de la molécule d'ADN de 50%[7].

Le filament de RAD51 utilise l'information de séquence de l'ADN simple brin pour interroger les molécules d'ADN alentour. Comme le filament de RAD51 possède une longue surface de contact continue, il engage de multiples molécules d'ADN double-brin, multipliant ainsi le nombre de têtes de lecture pour la recherche d'homologie[8]. L'ADN double-brin localement engagé est déstabilisé ce qui autorise la tentative d'association Watson-Crick avec l'ADN simple-brin receveur[9]. Cette recherche s'accompagne à l'échelle cytologique d'une augmentation de la mobilité des cassures dans le noyau, permettant potentiellement d'identifier des homologies distantes, telles que le chromosome homologue[10].

L'identification d'homologie au sein du filament de RAD51, lorsqu'elle excède une certaine taille, conduit à la conversion par la protéine RAD54 de ce complexe synaptique en un intermédiaire de molécules d'ADN jointes dont la stabilité ne dépend plus de RAD51[11]. Les brins receveur et donneur sont associés par complémentarité Watson-Crick en un "hétéroduplexe" d'ADN au sein d'une structure dite de "boucle de déplacement", ou D-loop. Cette structure peut être désassemblée par de nombreuses protéines régulatrices de la recombinaison homologue, dont l'action conduit à une plus grande stringence dans le choix de l'ADN donneur et promeut la stabilité du génome[12].

L'extrémité 3' de la molécule cassée se retrouve hybridé à son homologue intact au sein de la D-loop. Une polymérase ADN étend cette extrémité en utilisant l'ADN complémentaire intact comme matrice. C'est cette étape de synthèse qui permet la ré-acquisition de l'information perdue au site de cassure.

Une fois l'étape de synthèse accomplie, la D-loop peut être démantelée ou résolue. Plusieurs sous-mécanismes branchent à partir de cet intermédiaire[13].

Dans le modèle du SDSA, la D-loop est démantelée, et l'extrémité d'ADN étendue peut se réassocier à l'autre extrémité de la cassure grâce à la séquence nouvellement acquise. Suit alors une étape de synthèse d'ADN qui comble l'ADN simple brin généré par la résection sur les deux molécules.

Le modèle du DSBR postule la capture du brin déplacé par la synthèse au sein de la D-loop par le brin situé de l'autre côté de la cassure. Cette capture et la synthèse d'ADN qui s'ensuit conduisent à la formation d'un intermédiaire contenant deux hétéroduplexes, avec à leur frontière deux jonctions de Holliday. Des enzymes appelées "structure-selective endonucleases" reconnaissent et clivent ces jonctions[14]. Suivant les brins clivés, la résolution conduira ou non à un cross-over. Un cross-over implique la translocation entre la molécule initialement cassée et la molécule qui servait de matrice pour la réparation. Cette issue est généralement évitée dans les cellules somatiques mais est requise dans les cellules germinales pour la réalisation de la première division méiotique.

Dans le modèle du BIR, la synthèse d'ADN initiée au niveau de la D-loop se poursuit jusqu'à l'extrémité du chromosome[15]. Ce mode de réparation est principalement mis en œuvre au niveau d'une cassure d'ADN ne possédant pas de deuxième extrémité, comme celles générées par la cassure d'une fourche de réplication.

Les lésions double-brins peuvent être réparées par recombinaison homologue ou par recombinaison non-homologue (non-homologous end joining ou NHEJ). Contrairement à la recombinaison homologue qui utilise une molécule intacte comme matrice, le NHEJ rejoint simplement les deux extrémités de la cassure. Le NHEJ est actif tout au long du cycle cellulaire, alors que la recombinaison homologue n'est active qu'en phase S et G2, quand l'ADN a été répliqué et qu'une copie identique, intacte, et spatialement proche pour la réparation se trouve sous la forme de la chromatide sœur[16]. Le point de décision entre ces deux voies de réparation sont les protéines de résection: dès que l'un des deux brins de la cassure est dégradé, le substrat pour le NHEJ est perdu. Ce choix est sous le contrôle de régulations complexes dominées par l'antagonisme entre le 53BP1 (anti-résection) et BRCA1 (pro-résection) chez l'humain[17], dont les influences respectives sont soumises, via modifications post-traductionnelles (phosphorylation, sumoylation, ubiquitination, etc.) à la phase du cycle cellulaire. Notamment, les CDK (cyclin-dependent kinases), qui influent sur l'activité d'autres protéines par phosphorylation, sont des régulateurs importants de la recombinaison homologue chez les eucaryotes[18]. Chez S. cerevisiae, la CDK Cdc28 induit la recombinaison homologue en phosphorylant la protéine Sae2, qui initie la résection[19]^,[20].

La voie de recombinaison homologue consiste en la succession de nombreuses associations non-covalentes ADN-protéines et ADN-ADN qui peuvent être réversées. Cette capacité de réversion, contrôlée par de nombreuses protéines, limite la toxicité, augmente la fidélité, et détermine le produit de réparation (crossover ou non-crossover) de cette voie de réparation des cassures de l'ADN[2].

La dégradation directionnelle 5'-3' du brin d'ADN flanquant la cassure peut être réversé par synthèse d'ADN, initié par la Primase recrutée au site de cassure par le complexe Shieldin[21]. Cette étape réverse la décision d'engager la réparation par recombinaison homologue, et restore la possibilité de réparer par un mécanisme de "end joinding".

Le filament de RAD51 formé sur de l'ADN simple-brin peut être démantelé par de nombreuses hélicases chez l'humain, et Srs2 chez la levure S. cerevisiae. Ces activités contrecarrent la formation accidentelle de filament de RAD51, notamment lors de la réplication, et la formation d'intermédiaires d'échanges de brins toxiques. Pendant la réparation de l'ADN, ce démantèlement est contrecarré par les paralogues de RAD51 présents au sein du filament[22].

Les intermédiaires d'échange de brin de type D-loop peuvent être démantelés par de nombreuses protéines conservées chez les eucaryotes, telles que Mph1, Sgs1-Top3-Rmi1 et Srs2 chez S. cerevisiae[12]. Lorsque ce démantèlement survient avant initiation de la synthèse d'ADN au niveau de la D-loop, la voie de recombinaison est rétrogradée à l'étape de recherche d'homologie. Ces activités de démantèlement inhibent l'utilisation de séquences répétées pour la réparation, et promeuvent ainsi la stabilité du génome.

Lorsque le démantèlement survient après synthèse d'ADN, il permet la réassociation de l'extrémité étendue avec l'autre extrémité de la cassure, et ainsi la complétion de la réparation par "Synthesis-Dependent Strand Annealing". Cette branche de la recombinaison homologue, qui résulte exclusivement en la formation de non-crossover, est la plus conservatrice pour la stabilité du génome.