Mecanobiología

La microscopía de fuerza atómica, también conocida como Atomic Force Microscopy (AFM) en inglés, es una técnica óptica capaz de caracterizar superficies nanométricas, con magnitudes inferiores al límite óptico de difracción. Además proporciona mayor resolución que otras técnicas como: pinzas ópticas, técnicas magnéticas o la micropipeta.

En 1986, Binnig et al. [6] introdujo un nuevo tipo de microscopio que era capaz de estudiar las superficies de materiales aislantes a escala a atómica.

La aspiración con micropipeta es una técnica experimental que permite el estudio del comportamiento mecánico de las células de forma individual y su interacción mecánica con el entorno.[11] Con el mismo objetivo destacan también otros procedimientos como la microscopia de fuerza atómica (AFM), la citometría óptica, etc.

En esta técnica se genera una fuerza de succión que provoca una deformación en la superficie de la célula mediante su extensión hacia el interior de la micropipeta. Posteriormente, se analiza la longitud aspirada para conocer el comportamiento de la célula y calcular los parámetros elásticos y viscoelásticos que la caracterizan.[12] Otra aplicación novedosa de esta técnica es la caracterización de la adhesión celular [13].
Es una de las menos exigentes para implementar en un laboratorio, además de ser una técnica muy extendida y aceptada en bibliografía. Por el contrario, presenta algunas desventajas como que las medidas son más complicadas y requieren procesado de imagen digital posterior.

Análisis datos obtenidos experimentalmente

Las deformaciones sufridas por las células son del orden de los μm y las fuerzas necesarias para deformarlas varían entre 10 pN y 1 nN según la rigidez de las mismas. Es por esto que las tensiones y presiones medidas serán del orden de los pN/μm2 o nN/ μm2 (equivale a Pa o kPa, respectivamente).[14]

La fuerza (F) a la que se somete una célula estática en la micropipeta viene dada por el producto de la presión de succión y el área transversal de la micropipeta, ecuación (1). Sin embargo, la célula puede estar en movimiento debido al estiramiento de las microvellosidades; en este caso la fuerza viene determinada por la ecuación (2).[15]

Figura 1. Esquema de la realización del ensayo de aspiración con micropipeta. ∆P presión de succión. Rp radio de la micropipeta. Rc radio de la célula. Lp longitud de la célula aspirada.

${\displaystyle F=\Delta P\pi Rp^{2}}$ (1)

${\displaystyle F=\Delta P\pi Rp^{2}(1+{\frac {Ut}{Uf}})}$ (2)

Donde U_t es la velocidad de unión y U_f es la velocidad de movimiento libre. El resto de los parámetros quedan reflejados en la figura 1 de la realización del ensayo.

La tensión superficial que sufre la membrana celular durante la aspiración puede explicarse mediante la Ley de Laplace para una esfera de pared delgada. Si consideramos que la longitud aspirada es igual al radio de la micropipeta (punto crítico), la tensión superficial queda determinada por la ecuación (3).[14]

${\displaystyle Patm-Pp=\Delta P\ =2N({\frac {1}{Rc}}-{\frac {1}{Rp}})}$ (3)

Donde P_atm es la presión atmosférica, P_p es la presión en el interior de la micropipeta y N es la ley de Laplace para una esfera de pared delgada (ej.: valores experimentales en neutrófilos N~35 [N/m]).[12]

Modelos de comportamiento

Los modelos de comportamiento de esta técnica vienen determinados por la linealidad entre el cociente ${\displaystyle {\frac {Lp}{Rp}}}$ y la presión de succión aplicada (∆P). Esto permite determinar si la célula se encuentra en un estado sólido o líquido.

Para valores inferiores al punto crítico ${\displaystyle {\frac {Lp}{Rp}}=1}$ , relación esférica o semiesférica), se observa una relación lineal puesto que la célula se deformará a volumen constante. Por encima de este valor crítico (${\displaystyle {\frac {Lp}{Rp}}>1}$ ) se puede distinguir:

Figura 2. Gráfica de posibles comportamientos de la célula en la aspiración con micropipeta

• Líquido: Se tiene un comportamiento como líquido si la célula fluye al interior de la micropipeta. Esto es debido a que el radio de la célula fuera de la pipeta disminuye mientras que su recíproco aumenta. Este comportamiento se observa en células como los neutrófilos.[14]

• Sólido: Las células no se introducirán en la micropipeta y seguirán un comportamiento lineal por encima del punto crítico comportándose como sólido elástico debido a la rigidez de corte de la membrana que le otorga una resistencia a la cizalladura.[14] Algunas de estas células son los condrocitos, eritrocitos o células endoteliales.[16]

Modelos de simulación para el procesado de datos

Para la simulación de esta técnica se han desarrollado modelos numéricos axisimétricos de elementos finitos donde se tiene en cuenta, el contacto de la célula con la micropipeta y la no linealidad intrínseca del problema, para poder determinar tanto el módulo de elasticidad como la relación de Poisson.[11]

Estos modelos pueden implementarse en tecnologías futuras para la medición automática de propiedades mecánicas de células, basándose en esta técnica y también en el tránsito celular a través de constricciones de flujo [11].

Figura 3. Modelo axisimetrico. Célula deformada por la aspiración de la micropipeta. Simulación realizada por el software ABAQUS

Estos modelos pueden implementarse en futuras tecnologías para la medición automática de propiedades mecánicas de células. El problema mecánico y la no linealidad de la estructura requiere el uso de técnicas de elementos finitos, así como un proceso iterativo de cálculo para simular la carga de la célula. Se simula la micropipeta como una superficie rígida donde se produce el contacto con la célula. El contacto entre la célula esférica y la superficie del microcapilar se supone sin fricción.[11]

En la figura 3 se puede ver un ejemplo de la aplicación de un modelo axisimétrico con algunas aproximaciones donde se aprecia la célula deformada.

El uso de técnicas eléctricas se encuentra ampliamente desarrollado y son dos los campos en que más se está investigando: desarrollo de sensores basados en sistemas microelectromecánicos (MEMS) y aplicación de campos eléctricos para estimulación celular. Sistemas microelectromecánicos (MEMS)

Las fuerzas ejercidas por las células juegan un papel vital en procesos tan variados como la migración, la diferenciación o la apoptosis. El estudio de las propiedades mecánicas de células individuales es esencial para poder entender la relación entre la capacidad de las células de sentir y producir fuerzas y su función. En las últimas décadas se han desarrollado dispositivos basados en MEMS para caracterizar las propiedades mecánicas de las células, así como las fuerzas que ejercen. Los MEMS presentan unas dimensiones por debajo de 1 milímetro y constan de elementos cuyo tamaño oscila entre 1 y 100 micrómetros. De forma general, presentan una unidad central que procesa la información (microprocesador) y varios componentes que interaccionan con el entorno (microsensores). Una de las características principales de los MEMS es que, al trabajar en la escala micrométrica, la superficie específica (relación área superficial/volumen) de las muestras es muy elevada. Como consecuencia, los efectos de superficie, incluyendo las fuerzas electromagnéticas (cargas eléctricas y momentos magnéticos), predominan sobre los efectos volumétricos.

Se denominan Bio-MEMS a los sistemas MEMS aplicados al ámbito de la medicina y salud. La evolución de estos sistemas ha beneficiado en gran medida al campo del diagnóstico. A continuación, se van a presentar algunas de las principales aplicaciones de estos dispositivos, como son el estudio de fuerzas de tracción y contracción, rigidez de las células y su citoesqueleto.

• Estudios de fuerzas de tracción. A finales de los años 90, se desarrollaron dispositivos capaces de medir tracciones subcelulares permitiendo que pequeñas regiones de fibroblastos ejercieran fuerzas sobre micropalancas calibradas. Estos estudios permitieron cuantificar las fuerzas generadas por pequeños contactos adhesivos y demostraron que la fuerza ejercida por la célula no era continua. El análisis de las fuerzas ejercidas por las distintas regiones de las células permitió comprender mejor el mecanismo de migración celular [17]

• Estudios de rigidez celular. El desarrollo de sensores para el estudio de la mecanobiología continuó con el desarrollo de dispositivos capaces de caracterizar aspectos como la rigidez de las células y su citoesqueleto. Para ello fue necesario implementar la tecnología que permitiera laaplicación y medida de grandes deformaciones y fuerzas, reproduciendo la respuesta celular a daños y grandes esfuerzos [18][19]

• En relación con la respuesta celular al daño, cabría destacar el desarrollo de una micropalanca microfabricada con un biopolímero capaz de medir la fuerza de contractilidad ejercida por cardiomiocitos. Este dispositivo, diseñado inicialmente para el estudio de la función y disfunción cardiacas, se puede utilizar para el estudio de otros tejidos. [20]

Un área de gran interés científico y tecnológico es el desarrollo de sensores in vivo para la monitorización continua de la salud humana. Los beneficios del uso de MEMS con este fin es su gran rendimiento, elevada sensibilidad, rapidez de respuesta, control temporal, tamaño y coste.[21] Continuando en este ámbito, habría que destacar los dispositivos Micro TotalAnalysis, que automatizan e integran todos los procesos necesarios para el análisis químico de una muestra y que pueden aparecer integrados en dispositivos médicos, incluyendo los stents [22] o implantes cocleares.

Estimulación por campos eléctricos

Las células son entes vivos con una gran capacidad de adaptación. El control celular no depende únicamente de la propia célula, sino que señales externas también pueden producir cambios. La estimulación eléctrica se vale de dicho mecanismo, siendo posible inducir tanto su muerte (apoptosis) como su proliferación. También es posible inducir un desplazamiento de la célula e inducir su diferenciación.

Posibles efectos de la estimulación eléctrica de una célula

Las células utilizan impulsos eléctricos como un medio de señalización. A pesar de que no se conocen en detalle los mecanismos, es conocido que los campos eléctricos son capaces de alterar, entre otros, la producción de ATP.[23] Una disminución en la disponibilidad de energía produce alteraciones en el citoesqueleto,[24] lo cual deriva, entre otros, en alteraciones mecánicas de la célula.

Estos impulsos eléctricos son generados debido a gradientes iónicos y participan en el control de diversos procesos de proliferación, diferenciación y apoptosis, así como el control de la forma celular, tanto en células madre como en aquellas más diferenciadas [25]

Dado que el control no depende únicamente del impulso generado por la propia célula, sino que es susceptible al ambiente eléctrico próximo, el uso de campos eléctricos permite múltiples posibilidades, como el estudio de propiedades celulares, la elaboración de nuevas terapias o la mejora de las técnicas de proliferación in vitro entre otros. El potencial de membrana ha demostrado ser un aspecto clave en la generación de tumores y la regeneración de tejidos, siendo posible el uso de campos eléctricos para dirigir la diferenciación de dichas células.[26] Además de factores como la diferenciación y proliferación, numerosos estudios han revelado el efecto de la estimulación eléctrica sobre la migración celular.[27] El uso de campos eléctricos ha demostrado ser una técnica in vitro novedosa capaz de dirigir la diferenciación de células madre hacia diversos tipos celulares como osteocitos, cardiomiocitos o neuronas. Actualmente se continúan caracterizando los mecanismos de interpretación de las señales eléctricas por parte de las células, con el objetivo de poder definir los parámetros adecuados para su uso en ingeniería de tejidos.

Las técnicas acústicas aplicadas al estudio de las propiedades de la célula se basan en el empleo de ondas de sonido para la manipulación de células tanto de manera individual como colectiva. Permiten obtener desde medidas de adhesión celular y de interacción célula-superficie, hasta algunos parámetros mecánicos. Se trata de técnicas muy novedosas, todavía en proceso de desarrollo gracias a las distintas ventajas que presentan: son técnicas no invasivas, ya que las ondas acústicas pueden penetrar el objeto diana/la célula sin dañarlo, sencillas y baratas, que se pueden aplicar a una o varias células sin necesidad de pretratamientos.[28] Uno de los instrumentos más utilizados es el microscopio de ultrasonidos.

En cuanto a la mecánica celular, el microscopio de ultrasonidos permite obtener el módulo de compresibilidad y la densidad, así como distintos parámetros acústicos que caracterizan a la célula. Es una de las pocas técnicas que puede estudiar las propiedades mecánicas del interior de una célula. Su funcionamiento se basa en la reflexión de ultrasonidos en las interfaces de la célula.

Para llevar a cabo el ensayo, la célula se apoya en un sustrato y se rodea de un medio conductor que permita el paso de los ultrasonidos con la menor atenuación posible, como se puede ver en la Figura 1. El sustrato suele ser una placa de Petri y el medio conductor agua o medio de cultivo. Se envía una onda de ultrasonidos perpendicular a la célula y se recogen las ondas reflejadas: por un lado, el eco producido por la superficie de contacto entre la célula y el medio y, por otro, el reflejado en la interfaz célula-sustrato. De esta manera, se puede obtener directamente el espesor de la célula. A partir de esta medida, se calculan la velocidad del sonido en la célula, su impedancia acústica y coeficiente de atenuación. Una vez conocidos estos parámetros, se puede caracterizar mecánicamente la célula: su densidad y su módulo de compresibilidad.

Son los que dan una orden a ciertos elementos que pueden cambiar su comportamiento ante un estímulo. Un ejemplo: un sistema de riego. se podría considerar un medio de fluido, pero el dispositivo que activa el riego; podría asociarse a un control o máquina predeterminada.

Uno de los métodos para la caracterización de las propiedades mecánicas de las células se basa en la micromanipulación magnética. Consiste en el empleo de partículas magnéticas que son adheridas a la superficie de la célula que se quiere estudiar. Posteriormente, se aplica un campo magnético externo que desplace dichas partículas, pudiendo determinar sus propiedades mediante el empleo de pinzas magnéticas.

Las pinzas magnéticas son un instrumento científico empleado para la caracterización y manipulación de las células mediante el empleo de fuerzas y momentos de fuerza. La fuerza magnética resultante depende tanto de las propiedades del material y del tamaño de la partícula como del gradiente de dicho campo magnético, el cual puede ser generado empleando varias configuraciones.[31],[32],[33]

Para la realización de la técnica, uno de los extremos de la célula se une a una superficie mientras que el extremo libre se une a una partícula magnética. Estas uniones se suponen específicas a los extremos de la célula y que son capaces de soportar fuerzas sin afectar a las propiedades mecánicas y biológicas (véase Ilustración 1). Las pinzas magnéticas consisten en un par de imanes colocados encima de un soporte de muestras de un microscopio invertido, el cual está equipado con una cámara CCD conectada a un digitalizador de vídeo que captura el desplazamiento y rotación obtenidos. Estas pinzas son capaces de ejercer fuerzas superiores a 1 nN, y pueden ser empleadas para manipular e incluso rotar partículas magnéticas entre 0.5-5 μm. Las fuerzas son posteriormente cuantificadas con un análisis de las fluctuaciones laterales de la biomolécula en la dirección perpendicular a la fuerza aplicada.[34]

Estos campos magnéticos son generados con imanes permanentes móviles o con electroimanes. Mediante un único imán se puede lograr una fuerza atractiva en la partícula magnética, pero es necesario un mínimo de dos para generar una rotación, obteniendo además un gradiente magnético constante y el consecuente campo magnético homogéneo. Se trata de una técnica manejable que permite generar campos magnéticos que varíen con el tiempo.

Esta técnica posee una serie de ventajas e inconvenientes respecto a otras como el AFM o las ópticas:

Una de las ventajas de estas técnicas es la capacidad de las pinzas magnéticas de generar tanto fuerzas lineales como de torsión en la partícula. Además, al tratarse de manipulación magnética, se evita que se produzcan daños en las células como ocurre con el láser de las pinzas ópticas, por ejemplo. Por otro lado, esta técnica permite trabajar en un amplio rango de frecuencias y la realización de varias medidas simultáneamente. Por último, la instrumentación empleada es menos compleja con una implementación más sencilla, con un coste más bajo, en contraste con técnicas como el AFM o las pinzas ópticas.[35]

Sin embargo, a pesar de sus numerosas ventajas, las pinzas magnéticas no son tan versátiles como pueden ser otras técnicas como las pinzas ópticas o el AFM, debido a que la configuración del imán no es tan manejable. Por otro lado, los momentos aplicados son tan elevados que impiden que se pueda medir directamente la rotación generada. Además, el amplio rango de frecuencias y la sensibilidad que nos otorga la técnica es limitada por la detección del vídeo, no permitiendo que se puedan tomar desplazamientos muy pequeños o muy rápidos. Por último, para producir campos magnéticos altos o un gradiente magnético se requieren altas corrientes en los electroimanes, lo que puede producir calentamientos o polos inducidos que provocan variaciones en el campo aplicado dando lugar a una alteración en la fuerza constante aplicada, perdiendo una de las ventajas de esta técnica.

Un ejemplo en el que se emplea esta técnica es en el MTC (Magnetic twisting citometry), una herramienta capaz de analizar la transmisión de fuerzas a través de la membrana celular y calcular la rigidez celular y sus variaciones. Esta técnica consiste en inducir una tensión local de torsión en micropartículas magnéticas unidas a los receptores de membrana, mediante ligandos en los receptores celulares específicos, con el fin de medir las rotaciones producidas. La rotación de la partícula provoca que se generen tensiones mecánicas en la célula que se oponen a dicha rotación en la zona de unión con la misma. Así, midiendo el momento aplicado y la rotación de la partícula se puede deducir las propiedades mecánicas de la célula.[36],[37]

Otra aplicación del magnetismo en la mecanobiología celular es el inducir estímulos, mecánicos o de estrés, permitiendo el estudio de las señalizaciones que estos provocan en la célula.[38][39] Además, se pueden emplear campos magnéticos prolongados en el tiempo para inducir diferenciación celular selectiva con un elevado grado de precisión.[40],[41],[42]

Para modelar las diferentes interacciones dentro del entorno celular (célula-célula o célula-matriz, por ejemplo) se pueden utilizar herramientas de simulación computacional mediante métodos discretos, continuos o continuo-discretos (también llamados híbridos).

Este análisis computacional se puede utilizar cuando ocurra alguna de las siguientes situaciones:[43]

1. La cantidad de datos sea demasiado grande como para desarrollar una análisis manual
2. La reproducibilidad del análisis sea importante
3. La dinámica del sistema no pueda ser entendida intuitivamente
4. La escala temporal del experimento sea muy larga
5. Los elementos de interés no sean observables o controlables experimentalmente
6. Los experimentos conlleven implicaciones éticas

Simulación computacional: métodos discretos

Este tipo de método utiliza modelos de matemáticas discretas para simular la posición de un elemento biológico en distintos tiempos y las interacciones de ese elemento con su entorno biológico. Para ello, dicho elemento biológico se representa con una variable discreta, esto es, es almacenado como un objeto individual dentro de la simulación. Los métodos discretos se pueden clasificar como deterministas (sin componente aleatoria) o estocásticos (cuyas interacciones dependen del azar).

La principal característica de un modelo computacional discreto es que permite describir elementos a escala subcelular (proteínas, filamentos de actina...), de manera cuantitativa y mostrando la evolución temporal de los diferentes tipos de moléculas. La desventaja es que para llevar a cabo dicha simulación se requiere un alto coste computacional.[44]

Para desarrollar un modelo con métodos discretos se puede partir o no de imágenes tomadas en laboratorio o de un conjunto de datos experimentales que sirvan para establecer el modelo. Una vez que el modelo ha sido formulado, para lo cual pueden utilizarse distintos tipos de aproximaciones matemáticas (ecuaciones diferenciales lineales o no lineales, matriz de Leslie…), se lleva a cabo la simulación. Por último, hace falta validar el modelo, ya que la simulación no es exacta. Esto se debe a que no estamos resolviendo el modelo de manera general, sino para unos puntos predefinidos del espacio y/o tiempo; por lo tanto, la solución que nos proporcione esta simulación será una solución particular del modelo. Para validar esta simulación se lleva a cabo un mayor número de iteraciones, de modo que si el error disminuye con cada nueva iteración, podemos concluir que la simulación converge. De este modo queda verificado el modelo.

Aunque el modelo no nos proporcione una solución general, nos sirve para entender el comportamiento de lo que estamos simulando. Así, por ejemplo, nos permite ver qué sucedería ante distintas situaciones y cómo varían de una a otra según modifiquemos el valor de los parámetros. Por ello, los modelos discretos son muy utilizados en biología celular.

Las células biológicas están constantemente expuestas a tensiones mecánicas. En respuesta a estas tensiones, las células pueden cambiar su forma, migrar, adherirse al sustrato o cambiar su estado de otra manera (dividirse, morir, etc). Modelar estos fenómenos no es una tarea trivial debido a la complejidad biológica y a las diversas escalas implicadas. Para esta tarea, investigadores de diversas áreas (ingeniería, matemáticas, física, biología…) desarrollaron modelos basados en agentes para entender la dinámica de los tejidos según la actuación de las células. En estos modelos las células son consideradas como unidades separadas (por tanto, discretas) y se puede simular sus evoluciones dinámicas a lo largo del tiempo.

Se han desarrollado varios métodos para imitar a las células en el espacio. Podemos dividirlos en dos grandes familias: métodos que se basan en cuadrículas o redes y métodos que no utilizan cuadrículas para modelar las células en el espacio. Ambos permiten modelar el crecimiento, la migración, la división y la muerte celular.

Figura 1. Representación de los varios tipos de modelos con cuadrícula. A) Un cuadrado ocupado por muchas células. B) Un cuadrado ocupado por una sola célula. C) Una célula ocupando varios cuadrados.

En los modelos con cuadrícula (figura 1), un cuadradito puede estar ocupado por varias células, lo que permite modelar una gran población celular (tipo A); estar ocupado por una única célula (tipo B), lo cual se consigue, por ejemplo, mediante triangulación de Delaunay y diagramas de Voronoi; o una única célula puede ocupar varios cuadrados (tipo C). Este último modelo se conoce como modelo celular de Potts (Cellular Potts Model). Cada uno de estos tres métodos permite describir el efecto de las fuerzas mecánicas de una célula sobre su entorno o sobre un grupo de células vecinas. Existe también un cuarto método, llamado LGCA (Lattice Gas Celular Automaton), en el cual se añade una variable “velocidad”. Generalmente contiene varias células en un mismo cuadrado.[45]

Figura 2.

En los modelos sin cuadrícula (figura 2) podemos distinguir los modelos basados en un centro (center-based models) y los modelos de célula deformable (deformable cell models). Los primeros modelan las interacciones entre las células basándose en las fuerzas o energías entre los centros de las células, bajo la hipótesis de que la trayectoria que sigue cada célula en el espacio puede ser descrita mediante una ecuación de movimiento; aunque tienen la desventaja de que no permiten representar de manera aleatoria la forma de las células. Los segundos permiten representar formas complejas de células con muchos detalles, proporcionando resultados a nivel subcelular de fuerzas de tracción, compresión o cizalladura, entre otros. Además, también permiten incorporar modelos de adhesión específica (e.g. fuerza electroestática) y no específica (e.g. debido a las proteínas).[45]

A continuación se enumeran algunos ejemplos concretos que pueden ser encontrados en la literatura:

• Modelado de crecimiento de tumores, invasión y angiogénesis, donde se usan ecuaciones diferenciales no lineales que consideran la componente celular como discreta.[46]

• Modelado del comportamiento mecánico de los filamentos de actina presentes en los filopodios para entender el desplazamiento celular y la adhesión célula-matriz,[44] utilizando la ecuación de Langevin.

• Modelado de la matriz extracelular para conocer la interacción de las fibras de colágeno con los fibroblastos durante el proceso de regeneración de un tejido.[47] Los fibroblastos son tratados como objetos discretos cuyos caminos vienen dados por ecuaciones diferenciales ordinarias y afectan al modelo de manera estrictamente local, dada la baja densidad de estas células durante la regeneración