Electroforesis en gel

Esquema de preparación de un gel de electroforesis horizontal. La placa que se observa se introduce a continuación en una cubeta rellena de tampón de electroforesis y conectada a los electrodos.

La segunda parte del núcleo, gel se refiere a la matriz usada para separar las moléculas. En muchos casos un gel es un polímero entrelazado de porosidad controlable. Cuando la separación es de proteínas, ADN o ácidos nucleicos pequeños (ADN, ARN o ribonucleótidos), el gel está compuesto por diferentes concentraciones de acrilamida/bis-acrilamida y un iniciador de la polimerización, para producir redes de poliacrilamida de diferentes tamaños. Para separar ácidos nucleicos grandes (más de unos centenares de bases), la matriz empleada es agarosa purificada. En ambos casos, el gel forma una matriz sólida pero porosa. La acrilamida, en contraste con la poliacrilamida, es una neurotoxina y debe ser manipulada con precaución.

La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo, si están cargadas positivamente, y hacia el ánodo, si están cargadas negativamente (en una electroforesis, los electrodos se comportan igual que en una cubeta electrolítica).

Para generar la movilidad de las muestras a lo largo de sus carriles se requiere una fuente de poder que genere una corriente eléctrica. El voltaje que debe de ser aplicado depende del gel y de las muestras que se desean analizar. Usualmente la acrilamida es capaz de soportar una mayor corriente que la agarosa, sin embargo si el voltaje resulta ser demasiado, las bandas pueden verse difusas. Asimismo, si la corriente aplicada resulta ser excesiva para el sistema, puede provocar el derretimiento del gel, una curvatura en las bandas y un resolución. En caso de ser un voltaje insuficiente, la movilidad de las bandas más pequeñas se verá perjudicada y por lo tanto no se apreciará una adecuada visualización de las muestras .[2] Tomando todo esto bajo consideración, se recomienda voltajes de 25 a 100 V para geles de agarosa, mientras que para geles de poliacrilamida es importante conocer el largo del gel para determinar el voltaje apropiado. La distancia medida desde la parte superior hasta la parte inferior del gel se multiplica por un valor dentro del rango de 8-15 V, lo que permitirá determinar el voltaje de corrimiento apropiado .[1]

Cubeta para análisis de geles por electroforesis.

Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los ácidos nucleicos, o tinción de plata, azul de coomassie o tinción fluorescente, para las proteínas. Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografía.

Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirán separaciones paralelas (carriles). Cada carril mostrará distintas bandas correspondientes a cada componente de la mezcla. Si dos componentes poseen la misma masa las separaciones serán incompletas, por lo cual ambas bandas se verán solapadas.

Las bandas en diferentes carriles que se encuentran a la misma altura contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de tamaño conocido. Si se hace una electroforésis de una mezcla desconocida y se agrega un carril con un determinado marcador, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamaño o punto isoeléctrico. Sabiendo que el desplazamiento de las moléculas es proporcional al logaritmo de la masa, se puede estimar el peso molecular de una molécula de interés comparándola con el patrón de migración de los marcadores. Esto se realiza construyendo una curva con los valores del marcador, dónde el eje (y) representa el logaritmo del peso molecular y el eje (x) representa el Rf de cada banda. Luego, se calcula el Rf de la molécula incógnita y se extrapola en la curva el logartimo del peso molecular. Aplicando el antilogarítmo se obtiene el peso molecular de la proteína incógnita.

La electroforesis en gel se utiliza en biología molecular, genética y bioquímica:

• La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efectúa en geles de agarosa.
• La electroforesis de proteínas se lleva a cabo en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), isoelectroenfoque, geles nativos o electroforesis bidimensional.
• Electroforesis capilar.
• Electroforesis de ADN.
• Zimografía o zimogramas
• Extracción en gel.
• Electroforesis en gel de campo pulsado.[4]

• Bandow J, Baker JD, Berth M, Painter C, et al.: Improved image analysis workflow for 2-D gels enables large-scale 2-D gel-based proteomics studies - COPD biomarker discovery study. Proteomics 2008 (enlace roto disponible en Internet Archive; véase el historial, la primera versión y la última).
• Berth M, Moser FM, Kolbe M, et al: The state of the art in the analysis of two-dimensional gel eletcrophoresis images. Appl Microbiol Biotechnol. 2007;76(6):1223–43. (licencia Springer Open Access.)

• The state of the art in the analysis of two-dimensional gel electrophoresis images (enlace roto disponible en Internet Archive; véase el historial, la primera versión y la última).
• BIOtk - Análisis de proteinograma electroforético: BIOtk (enlace roto disponible en Internet Archive; véase el historial, la primera versión y la última).