Multímero

Muchos multímeros tienen funciones reguladoras; la unión de pequeñas moléculas puede alterar la interacción entre subunidades produciendo grandes cambios en la actividad de la proteína en respuesta a pequeños cambios en la concentración de sustrato o moléculas reguladoras. Las proteínas reguladoras impiden que se lleven a cabo reacciones metabólicas, por ejemplo, cuando estas no sean necesarias (por ejemplo, no se sintetizarán ácidos grasos a partir de glucosa cuando la célula requiera mucho aporte energético. Todo esto está regulado por los moduladores o proteínas reguladoras, muchas son multímeros).

En otros casos, las diferentes subunidades de un mismo multímero pueden llevar a cabo funciones separadas aunque relacionadas, tales como la catálisis y la regulación. Esto resulta de gran utilidad para la célula, ya que se suprime la necesidad de tener dos proteínas (una para la regulación y otra para la catálisis) juntando todo el proceso en una única proteína multimérica. Así esta proteína podrá autorregular la reacción que catalice, ahorrando espacio y aumentando la eficiencia celular.

Algunas asociaciones, como por ejemplo las proteínas fibrosas (colágeno) y las proteínas de cubierta de los virus, llamadas cápsides, tienen principalmente una función estructural, por tanto mantienen la conformación de la célula, y en el caso de los virus protegen la información genética del exterior.

Algunas estructuras proteicas son el sitio donde tienen lugar reacciones complejas con diversos pasos. Por ejemplo, cada uno de los ribosomas, lugar donde se produce la síntesis de proteínas, incorpora docenas de subunidades de proteínas junto con varias moléculas de RNA. Cada una de estas subunidades proteicas tiene una función específica en el proceso de la síntesis de proteínas: unión al mRNA, fijación de los tRNA, catalizador de la reacción de condensación para la formación del enlace peptídico entre aminoácidos, etc.[4]

Multímero homotípico formado por dos subunidades proteicas idénticas (por tanto, un homodímero) que presenta simetría proteica cíclica.

Estos son aquellos cuyas subunidades son idénticas o casi idénticas.

Las subunidades de estos multímeros se mantienen unidas mediante los mismos enlaces que estabilizan la estructura terciaria y que se describirán más adelante: puentes salinos, enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrófobas y a veces enlaces covalentes disulfuro.

Cada subunidad es una unidad asimétrica en el agregado, pero la estructura cuaternaria global de la proteína puede ofrecer una amplia variedad de simetría proteica en función de la geometría de las interacciones.

Un ejemplo de multímero homotípico sería la hemoglobina, que se ha descrito anteriormente.[4]

Cabe destacar que los multímeros homotípicos con únicamente dos subunidades se denominan homodímeros. En la imagen de la derecha podemos apreciar un multímero formado por dos subunidades iguales, por tanto un homodímero).[1]

Proteína interleukina. Se trata de un multímero heterotípico formado por dos subunidades proteicas distintas (por tanto un heterodímero). No presenta simetría proteica.

Estos son los que tienen varias subunidades con formas diferentes. En ocasiones, pueden tener una docena o más subunidades distintas.

Las interacciones que mantienen unidas estas subunidades son del mismo tipo que las descritas para los multímeros homotípicos: fuerzas no covalentes (excepto enlaces covalentes disulfuro) en las superficies proteicas complementarias.

Un ejemplo sencillo de multímero heterotípico es el de la proteína BPTI, el inhibidor de la tripsina pancreática bovina. Recibe este nombre porque se une al centro activo de la enzima tripsina formando un complejo fuerte y específico, inhibiendo de este modo la actividad proteolítica de la tripsina en el páncreas. Esta unión es un ejemplo de multímero heterotípico ya que el complejo BPTI-tripsina está formado por dos subunidades unidas fuertemente pero muy distintas estructuralmente.[4]

Hay que tener en cuenta que los multímeros heterotípicos que tienen sólo dos subunidades se denominan heterodímeros. En la imagen de la derecha podemos apreciar un multímero formado por dos subunidades de diferente estructura tridimensional (subunidades distintas), por tanto un heterodímero).[4]

Una vez se ha determinado el peso molecular nativo de la proteína, mediante la técnica del equilibrio de sedimentación, la manera más fácil de averiguar el peso o pesos moleculares de las subunidades consiste en utilizar la electroforesis en gel en presencia de SDS.

En estas condiciones, en presencia del SDS, la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas se descomponen todas. La cadena se despliega y se rodea de moléculas SDS. Las numerosas cargas negativas transportadas por las muchas moléculas de SDS unidas a la proteína hacen que la carga que transporta la proteína sea insignificante, quedando la proteína cargada negativamente. La cadena polipeptídica plegada se transforma en un objeto alargado, cuya carga es proporcional a la longitud (y por tanto, al peso molecular) de la cadena. Así pues, no hay ninguna proteína cargada positivamente después de pasar por un baño en SDS, y además la cantidad de carga negativa será independiente de la secuencia de aminoácidos, ya que únicamente dependerá de la longitud de la proteína.

Estas partículas (proteínas cargadas negativamente por efecto del SDS) migrarán en la electroforesis en gel con movilidades relativas, que dependen únicamente de sus longitudes. Entonces, si la electroforesis de la cadena proteica desconocida se lleva a cabo en el mismo gel que un conjunto de estándares de referencia, el peso molecular de la cadena desconocida puede medirse por interpolación en un gráfico. De esta manera conseguimos que las proteínas se separen por peso molecular gracias al efecto de un campo eléctrico que las separa por su cantidad de carga, pero como la carga depende únicamente de la longitud y el peso molecular de la proteína, estas quedan separadas según su peso molecular

Cuando se investigan las subunidades de una proteína mediante esta técnica, es aconsejable realizar dos experimentos: uno en presencia de un agente reductor de enlaces disulfuro como el β-mercaptoetanol y otro en su ausencia. De este modo, se distinguirá entre las subunidades que se mantienen unidas mediante puentes disulfuro y las que se mantienen juntas sólo mediante fuerzas no covalentes.[6][5]

• Si se encuentra una sola banda en cada uno de estos geles con SDS, correspondiente en peso molecular a la de la proteína nativa, podemos concluir que la proteína existe en condiciones fisiológicas como una única cadena polipeptídica.
• Si la banda o bandas observadas son de un peso molecular muy inferior, significa que se trata de un multímero (proteína con múltiples subunidades).

Se muestran patrones de bandas en dos dimensiones. En la vertical según el punto isoeléctrico de las proteínas, y en horizontal, según su peso molecular. Esto permite diferenciar las distintas subunidades de los multímeros.

Suponiendo que el examen indique que hay varias subunidades, ¿hay sólo un tipo o hay varios? La presencia de más de una banda en el gel con SDS es una indicación clara de que hay más de una subunidad. Pero hallar una única banda no demuestra que las subunidades sean idénticas. Porque puede haber varios tipos de subunidades con secuencias de aminoácidos distintas, pero con pesos moleculares idénticos; estas subunidades distintas no pueden diferenciarse con gel SDS. Para dejar claro que sólo está presente un tipo de cadena, se debe recurrir a otros métodos. Por ejemplo, el enfoque isoeléctrico (asilando las subunidades sin detergentes o agentes cariotrópicos) puede ser una técnica muy sensible.

Por lo tanto, hay que aislar estas subunidades y hacer un examen sin modificar su carga para poder así hallar diferentes subunidades en un mismo patrón de bandas en la electroforesis.

Un método muy utilizado en el laboratorio es la electroforesis bidimensional o Western Blot, que consiste en separar las proteínas primero según su punto isoeléctrico, y después según su peso molecular. De esta forma podemos obtener información sobre el tipo de subunidades que presentan las proteínas multiméricas.

En la electroforesis 2D se obtiene una imagen como la que se observa a la derecha.

Esquema de un espectrómetro de masas.

En los últimos años (2000-actual) se ha aplicado una técnica física antigua, la espectrometría de masas, para el estudio de las proteínas, que ha dado muy buenos resultados.

En el espectrómetro de masas, las moléculas se ionizan y posteriormente se aceleran a través del vacío mediante un campo eléctrico. Las partículas con distinta relación masa/carga se separan mediante su deflexión en un campo magnético o bien midiendo simplemente su tiempo de vuelo hasta un detector.

Cada molécula recibe una carga determinada (normalmente sólo unas pocas unidades electrónicas, + o -) durante su ionización. El campo eléctrico contiene un ánodo (la fuente) y un cátodo, que contiene una pequeña apertura para que pasen las moléculas. El campo eléctrico proporciona a cada molécula una energía cinética proporcional a su carga.

Consideremos dos macromoléculas de masa diferente, cada una de las cuales recibe una unidad de carga positiva. La energía cinética para cada una será la misma, pero sus velocidades serán diferentes, ya que E=1/2m(v^2) (fórmula de la energía cinética). Esto significa que, cuanto mayor sea la molécula, se moverá más lentamente.

De esta forma, midiendo el tiempo de llegada al detector a través de la región de deriva, en el espectrómetro de masas, se puede medir la masa molecular.

Los resultados pueden ser muy exactos, del orden de una parte por 10 000 para moléculas del tamaño de la hemoglobina, lo cual es suficientemente exacto para detectar pequeños cambios de la secuencia de aminoácidos.[6][5]

La técnica se ha ampliado para poder estudiar moléculas del tamaño de las inmunoglobulinas (alrededor de 150.000 Da).