EspectroscopÍa de resonancia magnética nuclear

Desde sus comienzos hasta finales de los 60, la espectroscopia de RMN utilizó una técnica conocida como espectroscopia de onda continua (CW). La manera de registrar un espectro de RMN en el modo de CW era, bien mantener constante el campo magnético e ir haciendo un barrido de frecuencias con un campo oscilante, o bien, lo que era usado más a menudo, se mantenía constante la frecuencia del campo oscilante, y se iba variando la intensidad del campo magnético para encontrar las transiciones (picos del espectro). En la RMN de CW las señales del espectro se registran como señales en resonancia.

La espectroscopia CW está limitada por su baja sensibilidad, ya que cada señal se registra una sola vez por cada barrido y la técnica de resonancia magnética nuclear ya es de por sí no demasiado sensible; esto quiere decir que la técnica sufre de una baja relación señal-ruido. Afortunadamente, en RMN es posible mejorar la relación señal-ruido mediante el promediado de señal. El promediado de señal consiste en repetir la adquisición del experimento e ir sumando los espectros que se obtienen. De esta manera, las zonas del espectro en que existen señales se suman de manera constructiva, mientras que, por su parte, las zonas en que hay ruido, por su carácter aleatorio, se acumula más lentamente que la señal. Mediante el promediado de señal se incrementa la relación señal-ruido en un valor que es la raíz cuadrada del número de espectros que se han acumulado. Esta relación se cumple con espectros de RMN en los que intervienen un solo tipo de núcleos, por ejemplo, sólo ¹H, ¹³C, etc., también llamados espectros homonucleares.

La técnica de RMN con transformada de Fourier (FT-NMR) es la que se utiliza en los espectrómetros actuales. Uno de los pioneros en este campo es Richard R. Ernst, que la desarrolló a partir del año 1966 y por la que fue galardonado con el Premio Nobel de Química en 1991.

FT-NMR permite disminuir drásticamente el tiempo que requiere adquirir una acumulación (scan) del espectro completo de RMN. En vez de realizar un barrido lento de la frecuencia, una en cada instante, esta técnica explora simultánea e instantáneamente todo un rango de frecuencias. Dos desarrollos técnicos fueron fundamentales para poder hacer realidad la técnica FT-NMR: ordenadores capaces de llevar a cabo las operaciones matemáticas necesarias para pasar desde el dominio de tiempo al de la frecuencia, es decir, para obtener el espectro; y el conocimiento sobre cómo poder excitar simultáneamente todo un rango de frecuencias.

La FT-NMR funciona con la muestra (espines nucleares) sometida a un campo magnético externo constante. Se irradia la muestra con un pulso electromagnético de muy corta duración en la región de las radiofrecuencias. La forma que suele usarse para este pulso es rectangular, es decir, la intensidad de la radiofrecuencia oscila entre un máximo y un mínimo que es constante mientras dura el pulso. Un pulso de corta duración tiene una cierta incertidumbre en la frecuencia (principio de indeterminación de Heisenberg). La descomposición de fourier de una onda rectangular contiene contribuciones de una de todas las frecuencias. El pulso que se genera es por tanto policromático y cuanto más corto sea, es capaz de excitar un mayor rango de frecuencias.

La aplicación de un pulso policromático en una región estrecha de la banda de radiofrecuencias (MHz) afecta a aquellos espines nucleares que resuenen en esa región. Un pulso policromático con una anchura en frecuencia de unos pocos kHz puede llegar a excitar simúltaneamente sólo a los espines nucleares de un mismo tipo de núcleo atómico dentro de una molécula, por ejemplo, todos los núcleos de hidrógeno (¹H). Antes del pulso el vector de polarización neta de cada uno de los espines nucleares se encuentra en situación de equilibrio alineado en la dirección del campo magnético. Durante el tiempo que se aplica el pulso, el pulso introduce un segundo campo magnético en una dirección perpendicular al campo principal del imán y el vector polarización realiza un determinado movimiento de precesión. Tras cesar el pulso, el vector polarización de todos los espines afectados puede formar un cierto ángulo con el eje del campo magnético principal. En este momento, los espines, comportándose como pequeños imanes polarizados, comienzan a precesionar con su frecuencia característica en torno al campo magnético externo, induciendo una pequeña corriente oscilante de RF en una bobina receptora situada en las inmediaciones de la muestra. A medida que los núcleos van regresando poco a poco a la situación inicial de equilibrio alineados con en el campo magnético principal, la señal detectada va disminuyendo de intensidad hasta hacerse cero. Esta caída de la señal se conoce como caída libre de la inducción (Free Induction Decay) (FID) y da lugar al espectro de RMN.

La señal que se detecta FID (Free Induction Decay) es una señal oscilante que contiene todas las señales del espectro y decae hasta hacerse cero.

La FID es una onda que contiene todas las señales del espectro en una forma que es dependiente del tiempo. Esta onda puede convertirse en un espectro de señales en función de su frecuencia. Para ello se utiliza una función matemática conocida como transformada de Fourier. El resultado es lo que se conoce como un espectro de RMN (espectro de frecuencias).

La posibilidad de excitar la muestra con uno o más pulsos de radiofrecuencia (RF), cada uno de ellos aplicado con una potencia, duración, frecuencia, forma y fase particulares, e introducirlos en momentos específicos de tiempo durante el experimento de RMN, generalmente antes de que el sistema haya regresado al equilibrio por relajación, permite diseñar toda una gama de secuencias de pulsos de las que se puede extraer información molecular muy variada.

Una secuencia de pulsos es una distribución en el tiempo de alguno o varios de los siguientes elementos: i) un cierto número de pulsos de RF que afecten a uno o más tipos de núcleos, ii) tiempos de espera en los que no se hace nada sino esperar a que el sistema evolucione de una determinada forma. Estos tiempos de espera pueden ser fijos o bien incrementables si su duración se va aumentando a medida que se repite el experimento. iii) gradientes de campo magnético y iv) una etapa final en la que se adquiere la FID.

En un experimento de RMN multidimensional la secuencia de pulsos debe constar de al menos dos pulsos y éstos deben separados por un periodo de espera incrementable. La secuencia de pulsos se repite un número de veces adquiriéndose una FID en cada ocasión. La fase de alguno de los pulsos puede alterarse en cada repetición así como incrementarse la duración de uno o más tiempos de espera variables. Si la secuencia de pulsos tiene un tiempo de espera incrementable el experimento tendrá dos dimensiones, si tiene dos será de tres dimensiones, si tiene tres el experimento será de cuatro dimensiones. Aunque en teoría no existe límite en el número de dimensiones de un experimento, experimentalmente hay limitaciones impuestas por la consiguiente pérdida de señal por relajación que conlleva la detección de las distintas dimensiones. Los tiempos de registro de los experimentos de RMN multidimensional se pueden acortar drásticamente con las técnicas rápidas de RMN desarrolladas en la presente década.

Los experimentos multidimensionales se pueden clasificar en dos tipos principales:

Experimentos de correlación homonuclear: Son aquellos en los que todas las dimensiones corresponden al mismo núcleo. Ejemplos: COSY (COrrelation SpectroscopY), TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY), NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY).

Experimentos de correlación heteronuclear: En este experimentos se obtienen espectros cuyas dimensiones pertenecen a diferentes núcleos. Ejemplos: HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation), HSQC (Heteronuclear Simple Quantum Correlation), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation), HOESY (Heteronuclear Overhauser Effect SpectroscopY).

Grosso modo, las interacciones que pueden detectarse por RMN se pueden clasisficar en dos tipos:

1. Las interacciones a través de enlaces se basan en el acoplamiento escalar
2. Las interacciones a través del espacio se basan en el acoplamiento dipolar. En el caso de muestras en disolución, el acoplamiento dipolar se manifiesta como efecto Overhauser nuclear que permite determinar la distancia entre los átomos.

Richard Ernst en 1991 y Kurt Wüthrich en el 2002 fueron galardonados con el premio Nobel de Química por su contribuciones al desarrollo de la RMN de 2-dimensiones y multidimensional con transformada de Fourier. Los avances conseguidos por ellos y por otros grupos de investigadores han expandido la RMN a la bioquímica, y en particular a la determinación de la estructura en disolución de biopolímeros como proteínas o incluso ácidos nucleicos de tamaño pequeño.