Secuenciación de proteínas

La hidrólisis se realiza al calentar una muestra de proteína con ácido clorhídrico 6 mol L^-1 a 100-110 °C durante 24 horas o más. Las proteínas con muchos grupos voluminosos e hidrofóbicos pueden requerir periodos de calentamiento mayores. Sin embargo, estas condiciones son tan fuertes que algunos aminoácidos (serina, treonina, tirosina, triptófano, glutamina y cisteína) se degradan. Para evitar este problema, se sugiere que se calienten muestras separadas durante diferentes tiempos, analizando cada disolución resultante y extrapolando a cero el tiempo de hidrólisis. También se sugiere una variedad de reactivos para prevenir o reducir la degradación como tioles o fenoles para proteger el triptófano y la tirosina del ataque del cloruro, así como pre-oxidar la cisteína. También se sugiere medir la cantidad de amoniaco formado para determinar la hidrólisis de las amidas.

Los aminoácidos pueden ser separados por cromatografía de intercambio iónico [4] y después derivatizados para facilitar su detección. Más comúnmente, los aminoácidos son derivatizados y después analizados por cromatografía de fase inversa.

Un ejemplo de la cromatografía de intercambio iónico se da por la NtrC (proteína C reguladora del nitrógeno) usando poliestireno sulfonatado como matriz (resina de intercambio iónico). Al añadir los aminoácidos en solución ácida y hacerlos pasar por un buffer que incremente poco a poco el pH, los aminoácidos son eluidos cuando el pH alcanza su respectivo punto isoeléctrico (pI). Como cada aminoácido posee un pI diferente, son separados. Una vez que los aminoácidos han sido separados, sus cantidades son determinadas al añadir un reactivo que formará un derivado colorido. Si las cantidades superan los 10 nmol, se puede utilizar ninhidrina, dando un color amarillo al reaccionar con la prolina y púrpura al reaccionar con el resto de los aminoácidos. La concentración de los aminoácidos es entonces proporcional a la absorbancia de la solución resultante (ley de Lambert-Beer) y se puede usar espectroscopía UV-visible. Con cantidades pequeñas (inferiores a los 10 pmol), se pueden formar derivados fluorescentes utilizando reactivos como ortoftaldehído o fluorescamina y se utiliza espectroscopía de fluorescencia.

La derivatización previa a la columna utiliza el reactivo de Edman para producir un derivado que es detectable por espectroscopía UV-visible. Una mayor sensibilidad es lograda al utilizar un reactivo que genere derivados fluorescentes. Los aminoácidos derivados son susceptibles de ser usados en cromatografía de fase inversa, usualmente usando una columna de gel de sílica C8 o C18 y un gradiente de elución optimizado. Los aminoácidos eluidos son detectados usando un detector de UV o de fluorescencia y los picos resultantes son comparados con estándares para cuantificar las muestras.

Péptidos mayores a 50 aminoácidos no pueden ser secuenciados confiablemente por la degradación de Edman pues aparecen interferencias. Debido a esto, cadenas proteicas largas deben ser separadas en fragmentos pequeños que después pueden ser secuenciados individualmente. La digestión se puede hacer mediante endopeptidasas como la tripsina o la pepsina o mediante agentes químicos como el bromuro de cianógeno. Enzimas diferentes dan patrones de separación diferentes. Los traslapes entre fragmentos pueden ser usados para construir una secuencia general.

El péptido a secuenciar es adsorbido en una superficie sólida. Un sustrato común es la fibra de vidrio cubierta con polibreno (un polímero catiónico). El reactivo de Edman, fenilisotiocianato, es añadido al péptido adsorbido junto con una solución buffer ligeramente básica de trimetilamina al 12%. Esto reacciona con el grupo amino del aminoácido N-terminal.

El aminoácido terminal puede ser desorbido selectivamente por la adición de un ácido anhidro. El derivado se isomeriza para dar una fenilhidantoína sustituida, la cual puede ser enjuagada e identificada mediante cromatografía, después, el ciclo se repite. La eficiencia de cada paso es del 98%, lo que permite que se identifiquen cerca de 50 aminoácidos antes de perder la confiabilidad.

Secuenciador Beckman-Coulter Porton LF3000G.

Un secuenciador de proteínas[5] es una máquina que permite llevar a cabo la degradación de Edman de manera automática. Una muestra de la proteína o péptido se coloca en el matraz de reacción del secuenciados y la degradación de Edman se lleva a cabo. Cada ciclo libera y derivatiza un aminoácido N-terminal de la proteína que es después identificado mediante HPLC. El proceso de secuenciación se repite para todo el polipéptido hasta que la secuencia completa se establece o hasta que se cumple un número de ciclos programado.

Un esquema general de la identificación de proteínas es el siguiente:

1. La POI se aísla, típicamente mediante SDS-PAGE o cromatografía.
2. La proteína asilada puede ser modificada químicamente para estabilizar la cisteína.
3. La POI es digerida con una proteasa específica para generar péptidos. La tripsina, que separa selectivamente el lado C-terminal de lisina y arginina, es la proteasa más usada. Entre las ventajas están: la frecuencia de aparición de la lisina y la arginina, la alta especificidad de la enzima, la estabilidad de la enzima y la compatibilidad de los péptidos trípticos para la espectrometría de masas.
4. Los péptidos deben ser desalinizados para remover contaminantes ionizables y después sujetos a espectrometría de masas MALDI-TOF. Las medidas directas de las masas de los péptidos pueden proveer información suficiente para identificar la proteína (huella peptídica) aunque una fragmentación posterior de los péptidos dentro del espectrómetro de masas usualmente es usado para conseguir información de las secuencias de péptidos. Alternativamente, los péptidos pueden ser desalinizados y separados por cromatografía de fase inversa e introducidos en un espectrómetro de masas mediante una fuente ESI. El método cromatografía líquida-ESI-espectrómetro de masas (LC-ESI-MS) para la identificación provee más información pero requiere más tiempo
5. Dependiendo del tipo de espectrómetro de masas, la fragmentación de iones peptídicos puede ocurrir mediante diversos mecanismos como la disociación por colisiones (CID, collision-induced dissociation) o decaimiento post-fuente (PSD, post-source decay). En cada caso, el patrón de los fragmentos iónicos de un péptido provee información acerca de su secuencia
6. La información incluye las masas medidas de los iones peptídicos y posteriormente, estos fragmentos son comparados contra valores calculados de la proteólisis conceptual (in-silico) y contra una base de datos. Una comparación exitosa será encontrada si su puntuación excede el umbral de los parámetros. Incluso si la proteína no está representada en la base de datos, algunas máquinas permiten la identificación basándose en la similitud con proteínas homólogas.
7. Los paquetes de software usualmente generan un reporte que muestra la identidad de cada proteína, su rango de similitud y una medida de la fuerza relativa de la similitud al identificar diversas proteínas.
8. Un diagrama de los péptidos encontrados en la secuencia es usada para mostrar el porcentaje de detección de la proteína. Cuando la POI es significativamente menor que la proteína de la base de datos, el diagrama puede sugerir que la POI es un fragmento de la proteína identificada.