Termoestabilidad

Las enzimas termoestables como la polimerasa Taq y la ADN polimerasa Pfu se utilizan en las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) en las que las temperaturas de 94 °C o más se utilizan para derretir las hebras de ADN en el paso de desnaturalización de la PCR.[10] Esta resistencia a altas temperaturas permite que la ADN polimerasa alargue el ADN con una secuencia deseada de interés con la presencia de dNTP.

Las enzimas a menudo se agregan a los alimentos para animales para mejorar la salud y el crecimiento de los animales de granja, en particular los pollos y los cerdos. La alimentación normalmente se trata con vapor a alta presión para matar bacterias como la Salmonella. Por lo tanto, las enzimas añadidas (por ejemplo, fitasa y xilanasa) deben ser capaces de resistir este desafío térmico sin inactivarse de forma irreversible.[11]

El conocimiento de la resistencia de una enzima a altas temperaturas es especialmente beneficioso en la purificación de proteínas. En el procedimiento de desnaturalización por calor, se puede someter una mezcla de proteínas a altas temperaturas, lo que dará como resultado la desnaturalización de las proteínas que no son termoestables y el aislamiento de la proteína que es termodinámicamente estable. Un ejemplo notable de esto se encuentra en la purificación de la fosfatasa alcalina del hipertermófilo Pyrococcus abyssi. Esta enzima es conocida por ser termoestable a temperaturas superiores a 95 °C y, por lo tanto, puede purificarse parcialmente mediante calentamiento cuando se expresa heterólogamente en E. coli .[12] El aumento de la temperatura provoca la precipitación de las proteínas de E. coli, mientras que la fosfatasa alcalina de P. abyssi permanece estable en solución.

Otro grupo importante de enzimas termoestables son las glucósidos hidrolasas. Estas enzimas son responsables de la degradación de la mayor parte de la biomasa, los polisacáridos presentes en el almidón y la lignocelulosa. Por lo tanto, las hidrolasas de glucósido están ganando un gran interés en las aplicaciones de biorrefinación en la futura bioeconomía.[13] Algunos ejemplos son la producción de monosacáridos para aplicaciones alimentarias, así como su uso como fuente de carbono para la conversión microbiana en combustibles (etanol) e intermedios químicos, la producción de oligosacáridos para aplicaciones prebióticas y la producción de surfactantes tipo glicósidos de alquilo. Todos estos procesos a menudo implican tratamientos térmicos para facilitar la hidrólisis del polisacárido, por lo que las variantes termoestables de glucósido hidrolasas tienen un papel importante en este contexto.

La ingeniería de proteínas se puede utilizar para mejorar la termoestabilidad de las proteínas. Se han utilizado varias técnicas de mutagénesis aleatoria y de sitio dirigido,[14][15] además de la evolución dirigida,[16] para aumentar la termoestabilidad de las proteínas diana. Se han utilizado métodos comparativos para aumentar la estabilidad de las proteínas mesófilas basándose en la comparación con los homólogos termófilos.[17][18][19][20] Además, el análisis del desdoblamiento de proteínas por dinámica molecular se puede utilizar para comprender el proceso de desdoblamiento y luego diseñar mutaciones estabilizadoras.[21] La ingeniería racional de proteínas para aumentar la termoestabilidad de las proteínas incluye mutaciones que truncan bucles, aumentan los puentes salinos[22] o los enlaces de hidrógeno, introducen enlaces disulfuro.[23] Además, la unión del ligando puede aumentar la estabilidad de la proteína, particularmente cuando se purifica.[24] Hay varias fuerzas diferentes que permiten la termoestabilidad de una proteína en particular. Estas fuerzas incluyen interacciones hidrofóbicas, interacciones electrostáticas y la presencia de enlaces disulfuro. La cantidad total de hidrofobicidad presente en una proteína en particular es responsable de su termoestabilidad. Otro tipo de fuerza responsable de la termoestabilidad de una proteína son las interacciones electrostáticas entre moléculas. Estas interacciones incluyen puentes salinos y enlaces de hidrógeno. Los puentes salinos no se ven afectados por las altas temperaturas, por lo tanto, son necesarios para la estabilidad de proteínas y enzimas. Una tercera fuerza utilizada para aumentar la termoestabilidad en proteínas y enzimas es la presencia de enlaces disulfuro. Presentan entrecruzamientos covalentes entre las cadenas polipeptídicas. Estos enlaces son los más fuertes porque son enlaces covalentes, lo que los hace más fuertes que las fuerzas intermoleculares.[25] La glicosilación es otra forma de mejorar la termoestabilidad de las proteínas. Los efectos estereoelectrónicos en la estabilización de las interacciones entre carbohidratos y proteínas pueden conducir a la termoestabilización de la proteína glicosilada.[26] La ciclación de enzimas mediante la unión covalente del extremo N-terminal al extremo C-terminal se ha aplicado para aumentar la termoestabilidad de muchas enzimas. A menudo se han empleado la ciclación Intein y la ciclación SpyTag/SpyCatcher.[27][28]