Microscopio de fuerza atómica

Micropalanca

Históricamente las primeras palancas tenían un tamaño de varios mm y solían fabricarse con metal, por ejemplo a partir de un hilo de tungsteno con un extremo afilado y doblado en ángulo recto para producir la punta. Más tarde se hizo necesario, para mejorar la velocidad de barrido sin perder resolución, que las palancas tuvieran masas cada vez menores y simultáneamente frecuencias de resonancia mayores. La solución a este problema se halló en la microfabricación de las palancas.

Las micropalancas se producen en la actualidad empleando métodos de microfabricación heredados inicialmente de la industria microelectrónica como litografía de superficie y grabados reactivos de plasma de iones (RIE y DRIE siglas en inglés de Reactive Ion Etching y Deep Reactive Ion Etching). Las puntas suelen fabricarse a partir de deposiciones de vapor de algún material idóneo sobre la palanca ya fabricada, en cuyo caso el resultado suele ser una punta cónica o más comúnmente, cuando el silicio es el material de elección, recurriendo a técnicas de grabado anisótropo. El grabado anisótropo involucra el uso de una solución de grabado que excava el material sólo o preferentemente en ciertas direcciones cristalográficas. De esta manera, es posible producir puntas piramidales limitadas por planos cristalográficos del material.

La fuerza de la micropalanca viene dada por el fabricante y se determina por la ley de Hooke. En este caso, la ley de Hooke se representa por la ecuación del resorte, donde se relaciona la fuerza F ejercida por el resorte con la distancia adicional x producida por alargamiento, del siguiente modo:

${\displaystyle F=-k\Delta x\,}$, siendo ${\displaystyle k={\frac {AE}{L}}}$

El ruido de Johnson-Nyquist, también conocido como ruido térmico, es un factor importante en la calibración de la micropalanca, pues está a su frecuencia de resonancia por la temperatura.

Existen actualmente distintos sistemas para medir la flexión del listón. El más común en instrumentos comerciales es el llamado óptica en este la flexión del listón se registra mediante un haz láser que se refleja en la parte posterior de la micropalanca para luego alcanzar un fotodetector. A este efecto, la mayor parte de las micropalancas (listones) de AFM se fabrican actualmente con una capa de oro de unas decenas de nm de espesor en su parte posterior para optimizar su reflectancia al haz del láser. Sin embargo históricamente el primer sistema de detección usado fue un microscopio de STM (efecto túnel). En este sistema una punta de STM era ajustada al listón siendo la flexión de este medida a través de la variación en la corriente de túnel, ya que dicha corriente es sensible a cambios subnanométricos en la distancia entre punta de STM y listón. La razón de que se pensara inicialmente en este sistema es que en su origen el microscopio de AFM se concibió como modificación del microscopio de STM para ser usado con muestras eléctricamente aislantes ya que el microscopio de STM sólo funciona con conductores. Posteriormente se pasó a sustituir este sistema de detección por un interferómetro y finalmente se introdujo la palanca óptica. Más recientemente se han incorporado nuevos métodos de detección basados en piezorresistividad o en medidas de capacitancia. Sin embargo ninguno de estos métodos «electrónicos» alcanza los niveles de resolución tanto espacial como temporal de la palanca óptica.

Por otra parte la palanca óptica presenta un problema de calibración que afecta especialmente a las medidas de fuerza. Este se debe a la necesidad que se da en las medidas de fuerza de registrar de forma precisa la flexión de la palanca en su extremo libre. Ya que el fotodiodo solamente registra el desplazamiento del punto de láser sobre su superficie es necesario calibrar este desplazamiento con una flexión real de la palanca para poder obtener medidas de flexión. Este procedimiento conocido como calibración de la sensibilidad se lleva a cabo imprimiendo una flexión conocida al extremo de la micropalanca mientras simultáneamente se registra la señal del fotodiodo. La forma más común de obtener una flexión conocida es presionar verticalmente el extremo de la palanca contra una superficie rígida, asegurando así que el desplazamiento vertical de la palanca equivale a flexión en su extremo.

Los métodos interferométricos o de efecto túnel no requieren de este procedimiento.

Ampliación a 3000x de una palanca usada de AFM.

Unos de los aspectos más importantes en la resolución de las imágenes obtenidas por AFM es la agudeza de la punta. Las primeras utilizadas por los precursores del AFM consistieron en pegar el diamante sobre pedazos de papel de aluminio. Las mejores puntas con radio de curvatura se encuentran alrededor de los 5 nm.

Existen tres tipos de influencias para formar las imágenes:

• ensanchamiento;
• compresión;
• interacciones punta-muestra:
  • en no contacto, fuerzas electrostáticas y magnéticas;
  • en casi contacto, fuerzas de Van der Waals;
  • en contacto, capilaridad y fuerzas de contacto;
• aspecto del radio.

En el barrido en modo contacto (figura a) la fuerza entre punta y muestra se mantiene constante, manteniendo una constante de deflexión. La deflexión de la punta estática se utiliza como una señal de retroalimentación.

La fuerza de adhesión es una fuerza fundamental en el modo contacto:

${\displaystyle F_{adh}=4\pi R\gamma _{L}\cos \theta }$

Donde ${\displaystyle \gamma _{L}}$ es la tensión superficial del agua, ${\displaystyle \theta }$ es el ángulo del menisco entre punta y muestra, y R hace referencia al radio de la punta y de la muestra.

En condiciones normales, la fuerza de adhesión es de unos 7 nN. La fuerza de adhesión es uno de los mayores inconvenientes del modo contacto en aire. En el modelo de Hertz se asume que la superficie es suave y continua, que el área de contacto es pequeña, y que no existen fuerzas de fricción ni adhesión. Sin embargo, la fuerza de adhesión es muy importante a escala nanométrica, afectando especialmente a la resolución lateral. Para superar este inconveniente, se utiliza el Jumping mode, un modo de contacto en el que se evitan las fuerzas laterales. El AFM en líquido supera también este problema, pues en líquido no existen fuerzas de adhesión.

El principal problema del modo contacto es que las muestras biológicas (blandas y delicadas) pueden dañarse. De ahí que funcione especialmente bien con muestras fuertemente adheridas a la superficie. En cristales de proteína, por ejemplo, las fuerzas laterales no modifican la muestra, pero sí en moléculas individuales.

En los modos dinámicos se hace vibrar la micropalanca a su frecuencia de resonancia valiéndose para ello del actuador piezoeléctrico. La interacción punta-superficie modifica la amplitud, frecuencia y fase de la resonancia, mientras el lazo de realimentación mantiene constante alguna de estas tres propiedades. Qué propiedad sea ésta es el criterio que determina el modo concreto de operación:

• En el Modo de no contacto o de frecuencia modulada (FM-AFM) (figura b) se mantiene constante la frecuencia de resonancia. La principal aplicación del FM-AFM es levantar topografías de superficies duras a escala atómica y operando en vacío extremo o UHV (de sus siglas en inglés Ultra High Vacuum)
• En el modo de repiqueteo (del inglés tapping mode) o modo de amplitud modulada (AM-AFM) (figura c) se mantiene constante la amplitud. Se usa principalmente en medio líquido para obtener imágenes de muestras biológicas que sólo son estables en soluciones acuosas.

Originalmente el uso del modo de no contacto implicaba que la punta se encontraba siempre a distancia constante de la superficie, mientras que en el modo de repiqueteo la punta golpeaba intermitentemente la superficie. Posteriormente se ha demostrado que ambos modos puden ser operados tanto a distancia de la muestra como en contacto con ella.

En el modo dinámico en líquido existen dos formas de hacer oscilar la micropalanca:

• En los modos acústicos se sitúa el piezoeléctrico, o bien en la parte trasera de la celda líquida, o bien bajo la muestra. En este caso, el movimiento de la muestra induce el de la micropalanca. La principal desventaja de este modo es que resulta en resonancias muy sucias.
• En los modos electrostático y magnético, la micropalanca se hace oscilar mediante un campo eléctrico o electrostático. La principal desventaja de este modo es que hay que metalizar las micropalancas.

El modo dinámico en líquido, además de tratarse de una técnica todavía en desarrollo, presenta fundamentalmente dos problemas:

1. Es menos sensible a las fuerzas de la interacción punta-muestra que el modo en aire. Esto es debido a la reducción en agua de la constante de amortiguamiento, lo que provoca que los cambios de la frecuencia de resonancia se manifiesten en la amplitud con menor sensibilidad.
2. Al existir contacto entre punta y muestra, se necesitan micropalancas más blandas con frecuencias de resonancia más altas.

Las aplicaciones del AFM en líquido son muy variadas: permite la resolución de problemas estructurales y la caracterización mecánica de proteínas, detectar el funcionamiento de proteínas in situ (como el desplegamiento de proteínas) y manipular proteínas individuales.

Con el fin de combinar la fuerza espectroscópica con la resolución nanométrica que se obtiene al crear una imagen de la topografía, varios métodos se han desarrollado. La principal diferencia entre estos métodos es la forma en que la punta se mueve a lo largo de la superficie. En cualquier caso, la idea es obtener una imagen razonable al mismo tiempo que una curva de fuerza contra distancia completa en cada punto de la imagen.

El mapeo de curvas de Fuerza (del inglés force volume mapping) fue propuesto por Radmacher et al.[5] Consiste en colectar una matriz de curvas fuerza contra distancia a lo largo de la superficie que son individualmente analizadas, perimitiendo una reconstrucción espacial de los mapas topográficos, de elasticidad y adhesión. Este método evita problemas de fuerzas laterales asociadas con el método de contacto, ya que la punta es completamente levantada de la superficie antes de moverse al siguiente punto. El inconveniente de este método es que requiere varios segundos requerir cada curva de fuerza. En el mejor de los casos las curvas se pueden obtener a 100 Hz.

El método imagen cuantitativa (del inglés quantitative imaging), también conocido como mapeo de fuerza rápido (del inglés "Fast Force Maping")fue desarrollado por la compañía JPK para colectar curvas de fuerza con mayor velocidad que con el mapeo de curvas de fuerza con el fin de obtener imágenes con mayor resolución en el mismo tiempo. Esto se logró moviendo la punta lateralmente al final del levantamiento de la punta y al inicio del acercamiento de la punta. En otras palabras los movimientos laterales no están completamente disociados. Sin embargo, durante la adquisición de la curva de fuerza contra distancia la punto no se mueve lateralmente, lo que es importante para obtener datos precisos. Adicionalmente todas las curvas de fuerza contra distancia son guardadas para un análisis posterior.

El método de pico de fuerza intermitente (del inglés "Peak Force Tapping") fue creado en 2009 por Veeco Instruments (empresa que actualmente pertenece a Bruker),[6] otras compañías han hecho acercamientos similares. Igual que en el método de Imagen Cuantitativa, la punta no se mueve lateralmente durante la curva de fuerza contra distancia. Sin embargo, se mueve más rápido cuando se mueve de un punto al siguiente. De hecho el acercamiento y el alejamiento de la punta a la muestra en función de tiempo es una función sinusoidal. La frecuencia a la que se mueve la punta en este mode es de 1 - 10 kHz,[7] la cual es mucho menor que la frecuencia de resonancia de la micropalanca. Con este método se pueden estudiar muestras con un módulo de Young menor a los 100 GPa.

Los métodos bimodales normalmente trabajan en el régimen repulsivo (modo de contacto intermitente). Se pueden utilizar modos bimodales porque el conjunto de la punta y la micropalanca en conjunto es un sistema mecánico que tienen un número discretos de oscilaciones discretas dados por las condiciones a la frontera. Por lo tanto se puede excitar en con dos señales diferentes, con dos bucles de retroalimentación distintos, de forma que la punta es forzada a oscilar en dos modos de vibración simultáneamente. Típicamente su usa la primera y la segunda resonancia de flexión aunque otras resonancias también funcionan. En la mayoría de los microscopios la señal de salida del primer modo (ya sea que se controle con la amplitud o con la variación en la frecuencia) es usado para obtener la topografía, mientras que el otro modo de flexión es usado para medir las propiedades mecánicas, eléctricas o magnéticas de la muestra.[8]

Los modos más comunes se muestran en la siguiente tabla, donde se detalla el tipo de retroalimentación para cada modo de resonancia y la propiedad del material que se puede estudiar: