Spectroscopie RMN

Origine du déplacement chimique.

Quand une molécule est placée dans le champ magnétique externe ${\displaystyle B_{0}}$, des champs magnétiques locaux sont créés par la circulation des électrons induite dans les diverses orbitales moléculaires sous l'action du champ. En effet une particule chargée se déplaçant dans un champ magnétique crée autour d'elle un champ magnétique local qui s'oppose, le plus souvent, au champ magnétique global (B₀). Le champ réellement « ressenti » localement par les noyaux n'est donc plus exactement le champ appliqué, mais la somme de B₀ et du champ magnétique créé par les électrons.

D'autres effets peuvent intervenir qui sont également susceptibles de modifier le champ local, comme le paramagnétisme électronique, lorsqu’il y a des électrons délocalisés (noyaux aromatiques, liaisons chimiques fortement polarisées, électrons non appariés…) ou non appariés qui vont au contraire augmenter le champ ressenti par les noyaux. C'est alors un effet paramagnétique.

La façon dont la fréquence de résonance de chaque noyau est affectée par ces champs locaux est caractérisée par une constante d'écran, ${\displaystyle \sigma }$, qui contient les contributions dia- et paramagnétiques :

${\displaystyle \nu _{L}=\nu _{0}(1-\sigma )}$

La différence de fréquence δ induite par les différents environnements électroniques est généralement appelée déplacement chimique.

Les utilisateurs de la RMN parlent souvent de blindage et de déblindage (en anglais, shielding et deshielding ; shield signifiant « bouclier ») par référence à l’amplitude de la constante d’écran ${\displaystyle \sigma }$. Plus un noyau est entouré d'électrons, moins il ressent le champ magnétique global B₀ et donc plus il est blindé et se retrouve sur la droite du spectre RMN (δ faible)[note 1]. À l'opposé, si un noyau est statistiquement appauvri en électrons par la présence d'un atome plus électronégatif ou d'un groupe mésomériquement attracteur, il est alors déblindé et se déplace vers la gauche du spectre (δ plus élevé). Ce concept est cependant peu recommandé car il néglige les effets paramagnétiques.

Il a toujours été primordial d'exprimer les déplacements chimiques indépendamment de l'intensité du champ magnétique utilisé surtout que les premiers spectromètres à « onde continue » utilisaient une fréquence d'observation constante (30, 60, 100 MHz, etc.) et un champ magnétique externe variable (aujourd'hui, avec les méthodes impulsionnelles, le champ magnétique est généralement fixe).

On a donc rapidement décidé de créer une échelle sans unité selon la formule suivante :

${\displaystyle \delta ={\frac {\mbox{fréquence de résonance – fréquence de résonance de la référence}}{\mbox{fréquence du spectromètre}}}\times 10^{6}}$ (en ppm)

c'est-à-dire :

${\displaystyle \delta ={\frac {\nu _{L}-\nu _{\text{réf}}}{\nu _{0}}}\times 10^{6}}$

Comme la différence entre la fréquence de résonance et la fréquence de résonance de la référence est de l'ordre du hertz alors que la fréquence du spectromètre est de l'ordre du mégahertz (un million de hertz), la valeur obtenue est donc exprimée en partie par million (ppm). Néanmoins cela suppose que l'on ait une substance de référence pour chaque noyau.

Pendant les années suivant l'apparition de la RMN en onde continue, il n'était pas réellement envisageable de faire autre chose que de la RMN du proton, grâce à sa sensibilité et son abondance naturelle. Dans la mesure où très peu de signaux dépassaient 10 ppm (voir ci-dessous), on a utilisé l'échelle τ (Tau) pendant 15-20 ans avec la relation : τ = 10 - δ. La référence pour le proton était, et est toujours, le tétramétylsilane (SiMe₄) en interne (donc mélangé avec la substance).

À l'heure actuelle, on utilise exclusivement l'échelle δ.

La référence choisie dépend de l'isotope étudié.

Par exemple pour le ¹H, ¹³C et ²⁹Si, le tétraméthylsilane (ou TMS) est choisi en général. Les références (relativement) inertes chimiquement peuvent être utilisées de façon interne, c'est-à-dire mélangées dans le solvant. C'est le cas du TMS qui est inerte, et facile à éliminer puisqu'il bout à 26,6 °C, à raison d'environ 0,03 %. Sinon, la référence est dite externe. Dans ce cas, on effectue un premier spectre avec le composé à étudier puis un second en insérant un capillaire rempli de la « référence externe ». Le second spectre permet de calibrer correctement le premier spectre. C'est notamment le cas pour la RMN du phosphore 31 dont la référence est l'acide phosphorique (H₃PO₄ à 85 %).

On peut également utiliser une référence secondaire, c'est-à-dire un composé dont le déplacement chimique est connu. Le plus souvent, il s'agit des protons résiduels du solvant deutéré pour le proton ou du signal du solvant s'il contient le noyau étudié. Cependant, cette méthode est moins fiable car le déplacement chimique des références secondaires internes varie avec la concentration et surtout le pH de la solution.

Le tableau suivant présente les références utilisées pour d'autres noyaux[5].

Représentation de l'interaction magnétique dipôle-dipôle ou couplage dipolaire pour une paire de spins nucléaires.

Représentation de l'interaction de couplage scalaire.

Les interactions dipolaires magnétiques entre deux spins couplés donnent lieu à une variation d'énergie de leurs états quantiques respectifs, et par conséquent modifient leurs résonances.

Cette interaction peut exister soit directement à travers l'espace (couplage dipolaire direct), soit par l'intermédiaire des électrons situés dans les orbitales moléculaires de liaison (appelé couplage dipolaire indirect, scalaire ou encore couplage J)[6].

Le couplage dipolaire direct dépend de la distance ${\displaystyle r_{ij}}$ entre deux noyaux ${\displaystyle i}$ et ${\displaystyle j}$ en interaction et de leurs rapports gyromagnétiques, ${\displaystyle \gamma _{i}}$ et ${\displaystyle \gamma _{j}}$.

L'intensité du couplage (souvent appelée constante dipolaire) peut être définie (en Hz) par :

${\displaystyle D_{ij}=-{\frac {{\mu _{0}}h}{4{\pi }}}{\frac {{\gamma _{i}}{\gamma _{j}}}{r_{ij}^{3}}}=-6,63\times 10^{-42}{\frac {{\gamma _{i}}{\gamma _{j}}}{r_{ij}^{3}}}}$

où ${\displaystyle \mu _{0}}$ est la perméabilité magnétique du vide.

Par exemple, deux protons séparés de 2Å présentent une constante dipolaire de -59,311 kHz[7].

Le déplacement des niveaux d'énergie produit un éclatement dipolaire, c'est-à-dire l'apparition d'un doublet à la place d'une résonance unique pour chacun des spins. La valeur de l'éclatement est donnée par :

${\displaystyle \Delta \nu _{ij}=kD_{ij}(3\cos ^{2}\beta _{ij}-1)}$

où ${\displaystyle \beta _{ij}}$ est l'orientation du vecteur internucléaire ${\displaystyle {\vec {r_{ij}}}}$, c'est-à-dire reliant les deux noyaux, par rapport au champ appliqué ${\displaystyle B_{0}}$.

${\displaystyle k}$ vaut 3/2 si les deux noyaux sont identiques, par exemple deux protons (couplage homo-nucléaire). Il vaut 1 dans le cas de deux noyaux différents (couplage hétéro-nucléaire).

Si les réorientations moléculaires sont très rapides comme dans les liquides, l'éclatement disparait, car la moyenne ${\displaystyle {\overline {(3\cos ^{2}\beta _{ij}-1)}}}$ s'annule.

Dans les solides, la mesure de l'interaction dipolaire est un moyen puissant d'obtenir les distances interatomiques[8].

Les couplages dipolaires directs (à travers l'espace) sont annulés dans les liquides, mais lorsqu'une liaison chimique existe les spins sont tout de même couplés via les électrons[9]. Ce couplage indirect qui résiste aux réorientations moléculaires est donc souvent appelé couplage scalaire (c'est-à-dire indépendant de l'orientation). Il se nomme aussi couplage « J » en spectroscopie RMN en référence à la constante ${\displaystyle ^{n}J_{ij}}$ qui en définit l'intensité (n indique le nombre de liaisons séparant les deux spins i et j).

Lorsque la différence de déplacement chimique en hertz (Δν) est supérieur à 5-10 fois la constante de couplage J (en valeur absolue), le couplage est dit du premier ordre. En dessous de cette limite, le couplage est dit du second ordre et cela peut compliquer notablement l'interprétation.

Le couplage dipolaire scalaire est un excellent indicateur de la présence de liaison chimique et une aide précieuse dans la détermination des structures de molécules organiques.

L'interaction quadripolaire[10] ne concerne que les isotopes atomiques de spin égal ou supérieur à 1. Ceux-ci représentent environ les 3/4 des isotopes observables en RMN, parmi lesquels des atomes très importants en chimie comme l'oxygène (¹⁷O), l'azote (¹⁴N) et le chlore (³⁵Cl, ³⁷Cl).

La principale caractéristique qui les distingue des noyaux de spin 1/2 comme l'hydrogène (¹H) ou le carbone (¹³C) est la présence d'un moment quadripolaire électrique[11] en plus du moment magnétique nucléaire. Ce moment est dû à une distribution anisotrope des charges dans le noyau. Ce moment quadripolaire électrique est susceptible d'interagir avec tout gradient de champ électrique non nul au niveau du noyau. Cette interaction quadripolaire est susceptible de modifier très fortement l'énergie des états quantiques et donc influence la fréquence de résonance et la relaxation.

Les effets sur la fréquence de résonance disparaissent dans les liquides à cause des réorientations rapides des molécules. L'interaction quadripolaire devient nulle également si le noyau dans un solide est localisé dans un environnement très symétrique (symétrie sphérique du gradient de champ électrique).

Représentation du tenseur de constantes d'écran par un ellipsoïde.

Dans la majeure partie des cas, les électrons n'ont pas une distribution sphérique autour du noyau. Cette distribution dépend beaucoup de la géométrie de la molécule, il en résulte que les interactions internes sont en général anisotropes.

Dans les solutions liquides, ce n'est pas important, car on n'observe qu'une valeur moyenne à cause des rapides réorientations moléculaires (mouvement brownien). Dans les solides par contre, la position des raies de résonance est alors fortement modifiée suivant l'orientation de la molécule, du cristal ou plus généralement de la cristallite.

Dans le cas du déplacement chimique par exemple, la constante d'écran ne sera plus représentée par un simple scalaire ${\displaystyle \sigma }$, mais par un tenseur du second ordre, ${\displaystyle {\overline {\overline {\sigma }}}}$ qui définit les composantes de la constante d'écran selon les différentes directions de l'espace. Il existe toujours trois directions particulières orthogonales, c'est-à-dire un système d'axes principaux, qui peuvent être choisies comme référentiel pour décrire l'interaction de telle sorte que le tenseur soit diagonal dans ce système d'axes. Ainsi :

${\displaystyle {\overline {\overline {\sigma }}}={\begin{pmatrix}\sigma _{xx}&0&0\\0&\sigma _{yy}&0\\0&0&\sigma _{zz}\end{pmatrix}}}$

Les trois scalaires ${\displaystyle \sigma _{xx}}$, ${\displaystyle \sigma _{yy}}$ et ${\displaystyle \sigma _{zz}}$, correspondent à la valeur de la constante d'écran selon les trois directions principales. Ce tenseur peut se représenter sous forme d'un ellipsoïde dont la forme dépend de la symétrie de l'interaction. Notamment, si l'interaction est de symétrie axiale (${\displaystyle \sigma _{xx}=\sigma _{yy}<\sigma _{zz}}$), l'ellipsoïde est un ellipsoïde de révolution. Si les trois valeurs sont égales, le système est isotrope et peut alors être décrit par une seule constante d'écran ${\displaystyle \sigma =\sigma _{xx}=\sigma _{yy}=\sigma _{zz}}$.

La fréquence de résonance de chaque noyau dépendra directement du tenseur d'écran et pourra s'écrire :

${\displaystyle \nu _{L}(\alpha ,\beta )=\nu _{0}(1-{\frac {1}{3}}[\sigma _{xx}\,\cos ^{2}\alpha \,\sin ^{2}\beta +\sigma _{yy}\,\sin ^{2}\alpha \,\sin ^{2}\beta +\sigma _{zz}\,cos^{2}\beta ])}$

où les angles ${\displaystyle \alpha }$ et ${\displaystyle \beta }$ sont les coordonnées angulaires sphériques donnant l'orientation de l'axe principal ${\displaystyle z}$ par rapport au champ magnétique ${\displaystyle B_{0}}$, et ${\displaystyle \nu _{0}}$ est la fréquence de Larmor, ${\displaystyle \nu _{0}={\frac {\gamma }{2\pi }}B_{0}}$

Les échantillons solides sont souvent analysés sous forme de poudre, c'est-à-dire qu'ils contiennent un ensemble de cristallite dont les orientations sont aléatoires. Le spectre de résonance observé correspondra alors à la superposition des résonances de toutes les cristallites présentes. Un tel spectre est appelé spectre de poudre et présente des formes caractéristiques de la symétrie du tenseur d'écran.

L'anisotropie de déplacement chimique est en général désignée par l'acronyme anglais CSA (pour chemical shift anisotropy).

L'interaction dipolaire est aussi anisotrope dans les solides, mais a la particularité d'être de symétrie axiale.

Bien que la RMN soit généralement appliquée sur des substances diamagnétiques, il n’est pas impossible de l’utiliser pour des substances paramagnétiques. Dans ce cas, il y a des effets particuliers dont il faut tenir compte car ils peuvent déplacer les résonances ou les élargir si fortement qu’il devient souvent difficile de les détecter.

Le déplacement de Knight K caractérise la fréquence RMN de noyaux atomiques dans un métal (par exemple le sodium) comparée à celle des mêmes noyaux dans un environnement non-métallique (par exemple, le sodium dans NaCl). Le déplacement observé reflète les champs magnétiques locaux produits sur les noyaux par l’aimantation des électrons de conduction. Ce déplacement généralement anisotropique peut être de l’ordre de milliers de ppm. Les déplacements chimiques des substances non-métalliques sont négligeables par comparaison.

Le spin des électrons non-appariés influence les résonances RMN de deux façons, par déplacement de contact (contact shift) ou de pseudo contact (pseudo-contact shifts). Les deux effets sont simultanés mais l’un d’eux peut être parfois prédominant. Le déplacement de contact résulte de la polarisation des spins électroniques transmise au travers des orbitales moléculaires. Le déplacement de pseudocontact résulte des champs magnétiques locaux produits par les centres paramagnétiques (c’est un couplage dipolaire électrons-noyaux qui varient donc en 1/r³).

Comme exemple, la résonance des protons dans le nickelocène est à environ -255 ppm, alors que dans le composé analogue diamagnétique, le ferrocène, elle se situe vers 5 ppm[12].

Le premier cas est appelé le lock en anglais (« verrouillage » en français mais ce terme est très rarement utilisé). Il s'agit de trouver une fréquence par rapport à laquelle on peut déterminer que le champ magnétique varie. Ce dernier varie inévitablement parce que l'aimant supraconducteur se décharge mais cela est un processus très lent. En revanche, n'importe quel objet ou personne en mouvement dans le champ magnétique va créer des variations brutales qui doivent être compensées rapidement.

En cas de variation, la fréquence d'excitation des différents noyaux est ajustée. Le moyen le plus simple de trouver une fréquence de référence est d'utiliser le signal du deutérium du solvant ; on utilise un solvant deutéré pour dissoudre les composés et la présence de deutérium en grande quantité est une aubaine. Le spectromètre effectue un balayage de fréquences pour observer le déplacement du signal du deutérium et répercute cette différence vers tous les noyaux.

En anglais, le terme « shim » désigne une sorte de cale. À l'origine de la RMN, il fallait en effet placer des cales à certains endroits pour homogénéiser le champ magnétique. Aujourd'hui, on a ajouté des électro-aimants capables de générer des champs magnétiques de différentes formes pour compenser les inhomogénéités de l'aimant supraconducteur, mais le terme est resté.

Le verbe anglicisé « shimmer » est donc devenu courant en RMN et, par extension, dans les domaines utilisant la RMN. On peut donc dire d'un spectre qu'il est bien/mal « shimmé ». Lorsque le spectre est "mal shimmé", les signaux observés ne sont pas symétriques. Des trainées à droite ou à gauche du signal sont alors observables.

Le réglage du shim peut se faire :

• manuellement : puisque le lock utilise le signal du deutérium (en dispersion), on peut également utiliser ce signal pour shimmer l'échantillon. Le signal en absorption est facilement détecté et ce signal est de plus en plus fin, et donc haut (puisque la surface est constante), lorsque l'homogénéité du champ s'améliore. Le réglage itératif du champ en z, z² et z³ avec rotation du tube permet de faire les derniers réglages du shim ;
• automatiquement :
  • sur les anciens spectromètres, le shim était effectué comme un shim manuel,
  • sur les nouveaux spectromètres Bruker, et avec la sonde adéquate, le shim automatique (seulement des bobines en Z) se fait par un programme appelé topshim qui utilise les gradients de champ pour déterminer les valeurs optimales des différents réglages. L'efficacité est d'autant meilleure que le nombre d'atomes de deutérium est élevé dans le solvant et que le champ est fort. Ceci peut poser problème avec du chloroforme deutéré sur un spectromètre de 300-400 MHz.

Afin de supprimer les défauts dus à l'électronique, à des radiofréquences parasites ou pour supprimer certains artéfacts, on alterne les impulsions et la détection selon les axes x, -x, y et -y. Ceci s'appelle le cycle de phase. L'addition ou la soustraction des différentes FID selon leur phase (positive ou négative) permet de supprimer les artéfacts qui, eux, conservent le même signe.

Pour un simple spectre du proton, on utilise en général un cycle de phase en huit étapes :

• impulsion : x, x, -x, -x, y, y, -y, -y ;
• détection : x, x, -x, -x, y, y, -y, -y

donc le premier scan s'effectue avec une impulsion selon l'axe x et la détection selon x. Le deuxième scan est identique. Le troisième s'effectue avec une impulsion en -x et une détection en -x également, etc.

La principale conséquence de ce cycle de phase est que le nombre d'acquisitions effectuées devrait toujours être un multiple du nombre d'étapes dans le cycle de phase.

Spectres 1H-RMN provenant d'une FID complète et de la même FID tronquée.

Le temps d'acquisition (AQ) ne peut pas être modifié directement. Il dépend de deux paramètres importants :

• le nombre de points utilisés pour numériser la FID ;
• la gamme spectrale (exprimée en Hz) à numériser.

${\displaystyle AQ={\frac {\mbox{ nombre de points }}{2\times {\mbox{ gamme spectrale }}}}}$ secondes.

Un temps d'acquisition trop long ne représente pas de problème, mis à part une perte de temps. En revanche, un temps d'acquisition trop court va tronquer la FID avant que celle-ci ne soit revenue à zéro. Ceci provoque une perte du signal, l'apparition d'artéfacts après la transformée de Fourier et, éventuellement, la perte des petites constantes de couplage (qui mettent plus de temps à se développer). Voir le schéma ci-contre.

Le délai de relaxation, à ne pas confondre avec le temps de relaxation, correspond à la période de temps nécessaire pour que tous les spins soient revenus à leur état fondamental. Il correspond à 5 * T₁, où T₁ est le temps de relaxation spin-réseau le plus long de la molécule.

Comme indiqué ci-dessus dans Temps d'acquisition, il faut indiquer la gamme spectrale (en Hz) à numériser ainsi que le nombre de points.

Selon le spectromètre, le nombre de points peut en fait correspondre au nombre de valeurs réelles et imaginaires, ce qui signifie que le nombre de valeurs complexes est en fait la moitié du nombre de points : une FID de 64 k va donc être un fichier de 32 k de valeurs réelles et 32 k de valeurs imaginaires. Au total, cela représente 32 k valeurs complexes.

La résolution sera donc la gamme spectrale divisée par le nombre de points réels : par exemple, 20 ppm en proton à 400 MHz représentent 8 000 Hz (20×10⁻⁶×400×10⁶). Si l'on choisit un nombre de points de 64 k, cela représente une résolution de 0,24 Hz/point (20×400/2). Cela est très correct en proton.

Afin d'améliorer la résolution, on applique souvent un zero-filling (le terme anglais), c'est-à-dire que l'on rajoute à la FID un certain nombre de points d'une valeur nulle ; en général, on double le nombre total de points. On utilise ensuite une multiplication exponentielle (voir Convolutions / fenêtrage ci-dessous) pour être sûr de ne pas avoir de troncature du signal. Ceci permet d'améliorer la résolution du signal en la divisant par deux. Cependant, il ne faut pas espérer révéler des couplages qui n'ont pas été détectés pendant l'acquisition.

La FID est une somme de sinusoïdes qui devraient être centrées sur zéro selon l'axe y. Un décalage vertical est possible et il peut être compensé par le logiciel de traitement RMN.

Comparaison de spectres RMN avec et sans amélioration gaussienne de la résolution : spectre de base en vert, spectre amélioré en noir.

Un certain nombre de fonctions mathématiques appliquées à la FID (apodisation ou fenêtrage) vont avoir des effets très importants sur le spectre obtenu. Parmi tant d'autres :

• EM : Exponential Multiplication en anglais. On multiplie la FID par une exponentielle inverse ce qui va annuler le signal en fin d'acquisition. Les pics les plus importants sont donc conservés alors que les signaux tardifs (le bruit de fond) est atténué, ce qui est particulièrement conseillé en cas de zero-filling. Cela permet d'augmenter notablement le rapport signal/bruit mais au détriment de la résolution car les pics sont élargis. Le seul paramètre est nommé LB (Line Broadening). Une valeur de 0,15 Hz est généralement employée en proton ou 1/100^e de la résonance du proton en ¹³C ou en ³¹P (soit 4 Hz pour un spectromètre à 400 MHz). C'est une des rares fonctions qui n'altère pas la possibilité d'intégrer les signaux ;
• amélioration de la résolution : certaines fonctions permettent, selon la valeur de leurs paramètres, d'augmenter la résolution du spectre au détriment du rapport signal/bruit. On peut citer la multiplication gaussienne (GM), le sinus (SIN) ou le sinus carré (QSIN). Voir ci-dessous.

La vraie transformée de Fourier n'est pas applicable en RMN car elle requiert une intégration de -∞ à +∞. On utilise donc ce que l'on appelle une transformée de Fourier discrète et, plus encore, une transformée de Fourier rapide qui est un algorithme très rapide, notamment si le nombre de valeurs est une puissance de 2. Ceci explique l'utilisation du « kilo » dans le sens informatique du terme : une puissance de 2 (${\displaystyle 1024=2^{10}}$).

Étapes lors de la correction de phase d'un spectre RMN : spectre initial en noir, après une correction à l'ordre 0 en vert suivi d'une correction d'ordre 1 en bordeaux.

Dans un spectre RMN simple, un signal est dit « phasé » lorsque son profil est positif et symétrique à gauche et à droite. Notamment, le signal doit s'élargir de la même façon à gauche et à droite pour se fondre avec la ligne de base.

Plusieurs phénomènes font que les signaux détectés sont déphasés par rapport au cas idéal :

• tous en même temps autour de l'axe δ (l'ordre zéro)

et

• les uns par rapport aux autres en fonction du déplacement chimique (l'ordre un).

Cette étape est assurée par le logiciel de traitement RMN de façon interactive avec l'utilisateur.

L'étalonnage s'effectue :

• en attribuant une valeur connue à la référence interne ou à une référence secondaire interne comme les signaux du solvant deutéré (ou des restes de solvant protoné) ;
• en menant une autre expérience avec une référence externe. Le décalage entre le signal mesuré et la référence est alors reporté dans le premier spectre.

Si cela n'est pas possible, un étalonnage par défaut est réalisé par le logiciel d'acquisition.

Une fois la phase correctement ajustée pour tous les pics, le logiciel de traitement RMN peut détecter les pics (positifs ou négatifs) par leur extremum. On utilise souvent le terme anglais peak picking pour cette étape.

Dans le cas idéal, toutes les expériences de RMN devraient aboutir à une ligne de base plane et centrée sur l'axe δ mais l'on n'est presque jamais dans ce cas. Les différentes méthodes de correction sont :

• le décalage (offset en anglais) : on centre la moyenne du bruit de fond à 0 sur l'axe y ;
• l'ajustement polynomial : on ajuste les valeurs selon un polynôme d'ordre variable ;
• le spline cubique : l'utilisateur indique les points devant être ajustés à la valeur zéro sur l'axe y. Une interpolation (bi)cubique est faite entre ces points et permet de corriger la ligne de base.

L'intégration est une simple addition des intensités des signaux entre deux valeurs de δ. Pour qu'elle soit bien faite, une intégration doit être effectuée entre -5 et +5 fois la largeur à mi-hauteur du pic considéré. Le résultat doit être une courbe qui commence et se termine par une ligne horizontale.

Les spectres RMN sont d'une complexité qui dépend de la molécule et du noyau étudié. Dans la majorité des cas en chimie organique, on va se baser sur la RMN du proton et la RMN du carbone 13. Si les spectres sont relativement simples, on peut attribuer les signaux aux différents noyaux en utilisant :

• Le déplacement chimique (δ) : des tables[13] donnent des gammes de déplacements chimiques pour les différents noyaux selon les groupes fonctionnels environnant.
• Les constantes de couplages.
• La multiplicité des pics : sauf pour le ¹³C (en général), la multiplicité du signal en ¹H, ¹⁹F, ³¹P donne des informations importantes sur le nombre de spins voisins.
• L'intégration des pics : sous réserve que l'expérience permette l'intégration des pics, cette intégration est proportionnelle au nombre de spins.

Si la structure n'a pas pu être complètement résolue, d'autres expériences simples peuvent être menées :

• Le DEPT en ¹³C permet de différencier les groupes C, CH, CH₂ et CH₃ très rapidement (le DEPT est environ quatre fois plus rapide que l'acquisition d'un spectre ¹³C).

Voir :

• RMN du proton
• RMN du carbone 13
• RMN du fluor 19
• RMN du phosphore 31

La spectroscopie de corrélation[14] est un type de spectroscopie 2D (bidimensionnelle) ou parfois nD (multidimensionnelle). Le tableau suivant donne quelques exemples de ce type de spectroscopie. La spectroscopie homonucléaire concerne un seul type d'isotopes et la spectroscopie hétéronucléaire concernent deux isotopes différents.

Les spectres à multiples dimensions donnent plus informations que les spectres classiques à une dimension et sont particulièrement utiles pour déterminer la structure d'une molécule, particulièrement celles qui sont trop complexes à étudier à l'aide la spectroscopie 1D.^{[réf. souhaitée]}

Historiquement, les protéines ont été étudiées par la RMN du proton (isotope ¹H) présent en abondance.

Une première étape consiste à attribuer les résonances, c'est-à-dire à établir une corrélation entre les signaux du spectre et les atomes d'hydrogène de la molécule. Deux expériences clefs sont utilisées, l'expérience de corrélation par les couplages scalaires (HOHAHA ou TOCSY) et l'expérience de corrélation à travers l'espace par effet Overhauser (NOESY). Cette attribution est dite séquentielle, car elle opère par positionnement relatif d'un noyau par rapport à ses voisins en utilisant l'information de la séquence peptidique. Ce processus d'attribution (semblable à un puzzle) devient de plus en plus complexe à mesure que la taille de la protéine augmente; de plus, l'effet Overhauser se transmet à travers l'espace et ne permet pas de distinguer des noyaux proches dans la séquence peptidique et ceux proches dans l'espace. Des erreurs sont donc possibles qui ne se détectent qu'à la fin du processus, lorsque certaines pièces du puzzle restent sur le tapis.

Une fois les spectres attribués, les informations sont alors utilisées de manière quantitative : les couplages scalaires renseignent sur les angles dièdres et les effets Overhauser sur des distances interatomiques (jusqu'à 4-6 angströms). Ces informations sont introduites dans des programmes de modélisation moléculaire, pour rechercher une ou plusieurs conformations de la molécule compatibles avec les données. La stratégie est comparable à celle du géomètre qui mesure des distances et des angles entre bâtiments et recalcule un plan de ville. Sauf que la portée des distances mesurées en RMN est faible par rapport aux objets évalués; l'accumulation des erreurs expérimentales et/ou le faible nombre de données conduisent à des structures localement mal définies.

Deux difficultés limitent la taille des macromolécules accessibles à la technique : la complexité des spectres et la largeur individuelle de chaque signal. Si la taille de la protéine double, le nombre de résonances du spectre va doubler sans que la dispersion (c'est-à-dire la largeur spectrale) n'augmente. Une solution consiste à recourir à un spectromètre RMN à plus haut champ et donc beaucoup plus coûteux. Si la taille double, la masse moléculaire augmente et la protéine tourne plus lentement sur elle-même par mouvement diffusif. Cela conduit à des signaux plus larges, car la relaxation transversale devient plus performante. L'augmentation du champ magnétique est sans effet et il faut trouver une autre parade au problème (réduction de la viscosité, réduction du nombre de protons voisins…).

Afin de résoudre les superpositions spectrales dans les grosses molécules, il s'avérait nécessaire de passer de la RMN 2D à la RMN 3D. Des essais peu fructueux ont été faits au début des années 1990 pour combiner les séquences HOHAHA et NOESY dans une expérience tridimensionnelle. Si on dispose d'une protéine entièrement enrichie en ¹⁵N et en ¹³C, on peut concevoir des expériences de corrélation entre spins, uniquement fondées sur des couplages scalaires et permettant de relier tout le squelette peptidique ainsi que les chaînes latérales. Les isotopes naturellement abondants sont respectivement le ¹⁴N (noyau quadripolaire) et le ¹²C (noyau invisible en RMN), mais la plupart des protéines étant obtenues par surexpression bactérienne, il est possible de faire des cultures sur des milieux enrichis isotopiquement.

Cette nouvelle stratégie fait appel à une série d'expériences « 3D triple résonance » : 3D car un spectre tridimensionnel est obtenu, triple résonance car les fréquences de trois noyaux différents sont détectées. Pour des raisons de sensibilité, toutes ces séquences partent du ¹H (noyau au rapport gyromagnétique élevé) et se terminent par la détection du même noyau. Dans l'expérience HNCO, on établit donc une corrélation entre le proton amide (^HN), son azote (N) et le carbonyle (CO) de l'acide aminé précédent. Les couplages scalaires utilisés pour les transferts de cohérence sont des couplages ¹J (à une liaison) et donc relativement importants (¹JNH = 90 Hz et ¹JNCO = 15 Hz). Cela assure donc une grande efficacité de transfert même dans le cas de protéines de masse élevées (largeur de raie). À noter que cette expérience HNCO permet de relier par couplage scalaire des acides aminés, ce que la stratégie homonucléaire ne permettait pas (absence de couplage scalaire 3J à travers la liaison peptidique).

Principe de la rotation à l'angle magique (MAS) d'un échantillon solide.

Dans les liquides, les mouvements browniens entrainent des réorientations très rapides de molécules, de sorte que seule la moyenne des interactions prise sur l'ensemble des orientations est mesurée. Dans les solides, ce n'est pas le cas puisque les mouvements des molécules sont souvent beaucoup plus lents que la mesure du signal RMN. Les spectres de poudres sont parfois très larges si le milieu est très anisotrope ; les spectres se superposent et la séparation d'espèces chimiques différentes en fonction de leur déplacement chimique par exemple n'est donc pas aussi facile que dans les liquides.

Dans les années 1960, Andrew[4] a montré cependant qu'il était possible d'obtenir des spectres correspondant à la moyenne isotrope des interactions en faisant tourner l'échantillon autour d'un axe incliné de arccos(1/√3) ≈ 54° 44' par rapport au champ magnétique. Cet angle est appelé, l’angle magique, et la technique de rotation à l'angle magique est en général désignée par son acronyme anglais : MAS (pour magic angle spinning)

Une condition essentielle pour que cette technique MAS soit réellement efficace est que la vitesse de rotation soit au moins de l'ordre de grandeur de l'amplitude de l'anisotropie. Ainsi pour moyenner efficacement l'interaction dipolaire entre un atome de ¹³C et un proton, la vitesse ou plutôt la fréquence de rotation doit être de l'ordre de 30 kHz (c'est-à-dire 30 000 tours par seconde). Ce sont des vitesses très importantes qui ne peuvent être obtenues qu'en plaçant l'échantillon dans de petits conteneurs cylindriques (le rotor) placés en rotation dans une turbine à coussins d'air. Les vitesses actuellement atteintes avec ces systèmes avoisinent les 90 kHz.

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• Imagerie par résonance magnétique
• Résonance magnétique nucléaire de corrélation

• (en) Recommendations IUPAC 1997
• (en) NMR Wiki (Open NMR project), un wiki consacré à la RMN
• (en) NMR Predictor, un simulateur de spectres RMN (1H et 13C)

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