Alineamiento de secuencias

Una matriz de puntos de ADN del factor de transcripción dedo de zinc en el ser humano (GenBank ID NM_002383), mostrando autosimilitud regional. La diagonal principal representa el alineamiento de la secuencia consigo misma; las líneas fuera de esta diagonal representan patrones similares o repetitivos dentro de la secuencia. Es un ejemplo típico de gráfica recurrente.

El enfoque de matriz de puntos (o matrix-dot), que implícitamente produce una familia de alineamientos para regiones individuales de la secuencia, es cualitativo y simple, a pesar de que consume mucho tiempo para análisis a gran escala. Es fácil identificar visualmente determinadas características de la secuencia (como inserciones, borrados, repeticiones, o repeticiones invertidas) en una gráfica de matriz de puntos. Para construir una gráfica de matriz de puntos, las dos secuencias se colocan a lo largo de la fila superior y de la columna que está más a la izquierda de la matriz de dos dimensiones y se coloca un punto en cualquier lugar en el que los caracteres en las columnas correspondientes coincidan (esta es una típica gráfica recurrente). Algunas implementaciones varían el tamaño o la intensidad de los puntos en función del grado de similitud de los dos caracteres, para dar cabida a las sustituciones conservadas. La gráfica de puntos de secuencias muy estrechamente relacionadas aparece como una única línea a lo largo de la diagonal principal de la matriz .

Las gráficas de puntos también pueden utilizarse para evaluar repetitividad en una sola secuencia: una secuencia se gráfica contra sí misma, y las regiones que comparten similitudes significativas aparecerán como líneas fuera de la diagonal principal. Este efecto puede ocurrir cuando una proteína consta de múltiples dominios estructurales similares.

La técnica de programación dinámica puede aplicarse para producir alineamientos globales mediante el algoritmo de Needleman-Wunsch, así como alineamientos locales mediante el algoritmo de Smith-Waterman. En una utilización habitual, en los alineamientos de proteínas se utiliza una matriz de sustitución para asignar puntuaciones a las coincidencias y a las diferencias entre aminoácidos, y una penalización por gap (literalmente hueco, aunque en buena parte de la literatura en castellano se utiliza el vocablo inglés) al hacer coincidir un aminoácido de una secuencia con un hueco en otra. En alineamientos de ADN y ARN puede usarse una matriz de puntuaciones, pero en la práctica, a menudo, se asigna simplemente una puntuación positiva a las coincidencias, una negativa a las diferencias, y otra penalización negativa a los gaps. (En la programación dinámica estándar la puntuación de la posición de cada aminoácido es independiente de la identidad de sus vecinos, por lo que los efectos del apilamiento de bases no se toman en cuenta. Sin embargo, es posible hacerlo modificando el algoritmo.)

La programación dinámica puede ser útil en el alineamiento de nucleótidos con secuencias de proteínas, una tarea complicada por la necesidad de tomar en consideración las mutaciones con cambio (inserciones o borrados, normalmente). La búsqueda del marco abierto de lectura proporciona una serie de alineamientos de pares locales o globales entre una secuencia de nucleótidos a investigar (secuencia problema) y un conjunto de búsqueda de secuencias de proteínas, o viceversa. A pesar de que el método es muy lento, su habilidad para evaluar la compensación de los marcos de lectura para un número arbitrario de nucleótidos lo convierte en útil para secuencias que contengan un buen número de indels, los cuales pueden ser muy difíciles de alinear con métodos heurísticos más eficientes. En la práctica, el método requiere una buena cantidad de potencia de cómputo, o un sistema cuya arquitectura esté especializada en programación dinámica. Las suites BLAST y EMBOSS proporcionan herramientas básicas para crear alineamientos adaptados (aunque alguno de estos enfoques saca ventaja de los efectos laterales de la capacidad de búsqueda de secuencias de las herramientas). Se consiguen métodos más generales tanto de fuentes comerciales (como “FrameSearch”, distribuido como parte del paquete Accelrys GCG), como de software de código abierto (como Genewise).

El método de programación dinámica garantiza encontrar un alineamiento óptimo dada una función de puntuación en particular; sin embargo, identificar una buena función de puntuación es, usualmente, más una cuestión empírica que teórica. A pesar de que la programación dinámica es extensible a más de dos secuencias, es prohibitivamente lenta para un alto número de secuencias extremadamente largas.

Los métodos de palabra corta, también conocidos como métodos de k-tuplas, son métodos heurísticos que no garantizan encontrar una solución de alineamiento óptima, pero son significativamente más eficientes que la programación dinámica. Estos métodos son especialmente útiles en búsquedas sobre bases de datos a gran escala, donde se asume que una larga proporción de las secuencias candidatas no tendrán coincidencias significativas con la secuencia problema. Los métodos de palabra corta son más conocidos por su implementación en las herramientas de búsqueda en bases de datos FASTA y la familia BLAST.[4] Estos métodos identifican en la secuencia problema una serie de subsecuencias cortas que no se solapan (“palabras”), y que se contrastan contra las secuencias de la base de datos. Las posiciones relativas de la palabra en las dos secuencias a comparar se restan para obtener un valor de desplazamiento; se manifestará así una región de alineamiento si varias palabras diferentes producen el mismo desplazamiento. Sólo si esta región es detectada, estos métodos aplicarán criterios de alineamiento más sensibles. De esta forma se eliminan muchas comparaciones innecesarias entre secuencias de similitud inapreciable.

En el método FASTA, el usuario define un valor “k” para definir la longitud de la palabra con la cual buscar en la base de datos. El método es más lento, pero más sensible, para valores bajos de “k”, que también son preferibles para búsquedas que impliquen una secuencia problema muy corta. La familia BLAST de métodos de búsqueda proporciona varios algoritmos optimizados para tipos particulares de problemas, tales como la búsqueda de coincidencias entre secuencias escasamente relacionadas. BLAST fue desarrollado para proporcionar una alternativa más rápida a FASTA sin sacrificar demasiada precisión. Al igual que FASTA, BLAST utiliza una palabra de búsqueda de longitud “k”, pero solo evalúa las coincidencias más significativas de las palabras, en lugar de cada coincidencia como hace FASTA. La mayoría de las implementaciones de BLAST usan una longitud de palabra fijada por defecto que se optimiza para el problema y el tipo de base de datos, y que se cambia sólo bajo circunstancias específicas tales como búsquedas con secuencias problema repetitivas o muy cortas. Pueden encontrarse implementaciones a través de varios portales web, como EMBL FASTA y NCBI BLAST.

La técnica de programación dinámica es teóricamente aplicable a cualquier número de secuencias; sin embargo, y puesto que es computacionalmente costosa tanto en tiempo como en memoria, raramente se usa en su forma más básica para más de tres o cuatro secuencias. Este método requiere la construcción de un equivalente n-dimensional a la matriz formada por dos secuencias, donde “n” es el número de secuencias problema. La programación dinámica estándar se usa primero en todos los emparejamientos entre las secuencias problema, por lo que el “espacio de alineamiento” se rellena considerando posibles coincidencias o huecos en las posiciones intermedias, construyendo, finalmente y en esencia, un alineamiento entre cada alineamiento de dos secuencias. Aunque esta técnica es computacionalmente costosa, su garantía de una solución global óptima es útil en casos donde sólo unas cuantas secuencias necesitan ser alineadas con precisión. Un método para reducir las demandas computacionales de programación dinámica, que depende de la función objetivo “suma de pares”, ha sido implementado en el paquete de software MSA.[6]

Los método progresivos, jerárquicos, o por árbol, generan un alineamiento múltiple de secuencias alineando primero las secuencias más similares, para ir añadiendo sucesivamente al alineamiento secuencias o grupos menos relacionados, hasta que el conjunto problema completo ha sido incorporado a la solución. El árbol inicial describiendo el parentesco de las secuencias se basa en comparaciones de emparejamientos que podrían incluir métodos de emparejamiento heurístico para alineamientos similares a FASTA. Los resultados del alineamiento progresivo dependen de la elección de las secuencias “más relacionadas”, por lo que pueden ser sensibles a imprecisiones en los alineamientos de emparejamientos iniciales. La mayoría de los métodos progresivos de alineamiento múltiple de secuencias ponderan adicionalmente las secuencias en el conjunto problema de acuerdo a su parentesco, lo que reduce la probabilidad de efectuar una pobre elección de las secuencias iniciales y así se mejora la precisión del alineamiento.

Un buen número de variaciones de la implementación progresiva de Clustal[7][8][9] se utilizan para alineamientos múltiples de secuencias, construcción de árboles filogenéticos, y como entrada para la predicción de estructura de proteínas. Una variante del método progresivo más lenta pero más precisa se conoce como “T-Coffee” (Tree-based Consistency Objective Function For alignment Evaluation),[10] de la que pueden encontrarse implementaciones en ClustalW y T-Coffee.

Los métodos iterativos intentan mejorar el punto débil de los métodos progresivos: su fuerte dependencia de la precisión de los alineamientos de los emparejamientos iniciales. Los métodos iterativos optimizan una función objetivo basada en un método seleccionado de puntuación de alineamiento mediante la asignación de un alineamiento global inicial y el posterior realineamiento de subconjuntos de secuencias. Los subconjuntos realineados son entonces alineados consigo mismos para producir la siguiente iteración de alineamiento múltiple de secuencias. Se encuentran bajo análisis varias formas de selección de los subgrupos de secuencias y de la función objetivo.[11]

Para el descubrimiento de motivos, o análisis de perfiles, se construyen alineamientos múltiples globales de secuencias que intentan alinear secuencias motivo cortas conservadas entre las secuencias del conjunto problema. Se hace, habitualmente, construyendo primero un alineamiento múltiple de secuencias global, tras el cual las regiones altamente conservadas se identifican y se utilizan para construir un conjunto de matrices de perfil (también denominadas matrices ponderadas o matrices de pesos). La matriz del perfil de cada región conservada se dispone como una matriz de puntuación, pero sus cifras de frecuencia para cada aminoácido o nucleótido en cada posición se derivan de la distribución de los caracteres de la región conservada, en lugar de una distribución empírica más general. Las matrices de perfil se usan para buscar ocurrencias del motivo que caracterizan en otras secuencias. En los casos en los que el conjunto de datos original contenga un pequeño número de secuencias, o sólo secuencias muy relacionadas, se añaden pseudocontadores para normalizar las distribuciones de caracteres representadas en el motivo.

Una variedad de algoritmos generales de optimización usados comúnmente en ciencias de la computación se han aplicado también al problema del alineamiento de secuencias. Los modelos ocultos de Márkov se han utilizado para producir registros de probabilidades para una familia de posibles alineamientos múltiples de secuencias sobre un conjunto problema dado. Aunque los primeros métodos basados en estos modelos eran de rendimiento poco brillante, aplicaciones posteriores los han encontrado especialmente efectivos para detectar secuencias remotamente relacionadas, puesto que son menos susceptibles al ruido creado por sustituciones conservativas o semiconservativas.[12] Los algoritmos genéticos y el simulated annealing se han usado para optimizar las puntuaciones de alineamientos múltiples de secuencias, valorándolos mediante una función de puntuación como la del método de suma de pares.

El método DALI (del inglés, Distance matrix ALIgnment, alineamiento de matriz de distancias), es un método fragmentario para construir alineamientos estructurales basados en contactar patrones de similitud entre sucesivos hexapéptidos en las secuencias problema.[15] Puede generar emparejamientos o alineamientos múltiples, e identificar los vecinos estructurales de una secuencia problema en el Protein Data Bank (PDB). Se ha usado para construir la base de datos de alineamientos estructurales FSSP (del inglés Families of Structurally Similar Proteins, familias de proteínas estructuralmente similares). Puede accederse a un servidor web de DALI en base de datos DALI, y la FSSP se localiza en la.

SSAP (del inglés Sequential Structure Alignment Program, programa de alineamiento de estructura secuencial) es un método de alineamiento estructural basado en programación dinámica que usa vectores “átomo a átomo” en el espacio de la estructura como puntos a comparar. Se ha extendido desde su descripción original para incluir tanto alineamientos múltiples como emparejamientos,[16] y se ha usado en la construcción del CATH (del inglés Class, Architecture, Topology, Homology; clase, arquitectura, topología, homología), base de datos jerárquica de clasificación de plegamientos de proteínas.[17] La base de datos CATH puede accederse en la Clasificación de Estructura de Proteínas CATH.

El método de extensión combinatoria para alineamiento estructural genera un alineamiento estructural de pares usando geometría local para alinear fragmentos cortos de las dos proteínas a analizar, y juntar entonces estos fragmentos en un alineamiento mayor.[18] Basado en medidas como la raíz del error cuadrático medio en superposición de proteínas como sólidos rígidos, distancias entre residuos, estructura secundaria local, y características medioambientales circundantes tales como la hidrofobicidad de los residuos vecinos, se generan alineamientos locales llamados “pares de fragmentos alineados” que se usan para construir una matriz de similitud representando todos los alineamientos estructurales posibles dentro de un criterio de corte predefinido. Se traza, entonces, una trayectoria desde un estado de la estructura de una proteína a otro a través de la matriz, extendiendo el creciente alineamiento un fragmento cada vez. La trayectoria óptima define el alineamiento por extensión combinatoria. Un servidor web que implementa el método y proporciona una base de datos de emparejamientos de estructura en el Protein Data Bank se localiza en el sitio de Combinatorial Extension.

Para producir buenos alineamientos es importante la elección de una función de puntuación que refleje observaciones biológicas o estadísticas sobre secuencias conocidas. Las secuencias de proteínas son alineadas usando frecuentemente matrices de sustitución que reflejan las probabilidades de particulares sustituciones carácter por carácter. Una serie de matrices denominadas matrices PAM (del inglés Point Accepted Mutation, mutación puntual aceptada, originalmente definidas por Margaret Dayhoff, por lo que a veces se denominan matrices Dayhoff) codifican explícitamente las aproximaciones evolutivas considerando las frecuencias y probabilidades de mutaciones particulares de aminoácidos. Otra serie común de matrices de puntuación, conocidas como BLOSUM (del inglés Blocks Substitution Matrix, matriz de sustitución de bloques), codifica probabilidades de sustitución derivadas empíricamente. Se utilizan variantes de ambos tipos de matrices para detectar secuencias con diferentes niveles de divergencia, permitiendo así a los usuarios de BLAST o FASTA restringir sus búsquedas a coincidencias más cercanamente relacionadas, o extenderlas para detectar secuencias más divergentes. Las penalizaciones por gaps representan la introducción de huecos (en el modelo evolutivo, una mutación por inserción o borrado) en secuencias tanto de nucleótidos como de proteínas, y estos valores de penalización, por lo tanto, deberían ser proporcionales a la frecuencia esperada de tales mutaciones. La calidad de los alineamientos producidos depende, en consecuencia, de la calidad de la función de puntuación.

Puede resultar muy útil e instructivo intentar el mismo alineamiento diferentes veces con diferentes elecciones de matrices de puntuación y/o diferentes valores de penalización por huecos, y comparar los resultados. Las regiones donde la solución sea poco consistente, o no sea única, pueden ser identificadas a menudo observando qué regiones del alineamiento son robustas a variaciones en los parámetros de alineación.