Cinética enzimática

• Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad por este factor. Los rangos de temperaturas óptimos pueden llegar a variar sustancialmente de unas enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima verá incrementada su actividad hasta el momento en que comience la desnaturalización de la misma, que dará lugar a una reducción progresiva de dicha actividad.
• pH: el rango de pH óptimo también es muy variable entre diferentes enzimas. Si el pH del medio se aleja del óptimo de la enzima, esta verá modificada su carga eléctrica al aceptar o donar protones, lo que modificará la estructura de los aminoácidos y por tanto la actividad enzimática.
• Concentración salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados, la concentración de sales del medio es crucial para una óptima actividad enzimática. Una elevada concentración o una ausencia de sales en el medio pueden impedir la actividad enzimática, ya que las enzimas precisan de una adecuada concentración de iones para mantener su carga y su estructura.

Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catálisis no muestra un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la concentración de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato (representado como ${\displaystyle {\rm {[S]}}}$), la velocidad de la reacción (representado como ${\displaystyle V}$) aumenta linealmente con el aumento de la ${\displaystyle {\rm {[S]}}}$, como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la ${\displaystyle {\rm {[S]}}}$, la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima ${\displaystyle V_{\rm {max}}}$, que no sobrepasará en ningún caso, independientemente de la ${\displaystyle {\rm {[S]}}}$.

Mecanismo de unión de único sustrato para una reacción enzimática. k₁, k_-1 y k₂ son las constantes cinéticas para cada una de las etapas de la reacción.

El modelo de cinética michaeliana para una reacción de único sustrato se puede ver en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reacción química bimolecular entre la enzima ${\displaystyle {\rm {E}}}$ y el sustrato ${\displaystyle {\rm {S}}}$, formándose el complejo enzima-sustrato ${\displaystyle {\rm {ES}}}$. Aunque el mecanismo enzimático para una reacción unimolecular ${\displaystyle {\rm {ES\longrightarrow E+P}}}$ puede ser bastante complejo, existe una etapa enzimática limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cinética única cuya constante es ${\displaystyle k_{2}}$.

${\displaystyle {\begin{matrix}v=k_{2}[{\mbox{ES}}]\end{matrix}}}$     (Ecuación 1)

${\displaystyle k_{2}}$ también llamado ${\displaystyle k_{\rm {cat}}}$ o número de recambio, hace referencia al máximo número de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo.

A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre ${\displaystyle {\rm {E}}}$ y el complejo enzima-sustrato ${\displaystyle {\rm {ES}}}$. Aumentando la ${\displaystyle {\rm {[S]}}}$ también aumentamos la ${\displaystyle {\rm {[ES]}}}$ a expensas de la ${\displaystyle {\rm {[E]}}}$, desplazando el equilibrio de la reacción hacia la derecha. Puesto que la velocidad de reacción depende de la ${\displaystyle {\rm {[ES]}}}$, la velocidad es sensible a pequeños cambios en la ${\displaystyle {\rm {[S]}}}$. Sin embargo, a altas ${\displaystyle {\rm {[S]}}}$, la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ${\displaystyle {\rm {ES}}}$. Bajo estas condiciones, la velocidad de la reacción (${\displaystyle v\approx k_{2}\mathrm {[E]_{tot}} =V_{\rm {max}}}$) deja de ser sensible a pequeños cambios en la ${\displaystyle {\rm {[S]}}}$. En este caso, la concentración total de enzima (${\displaystyle {\rm {[E]_{tot}}}}$) es aproximadamente igual a la concentración del complejo ${\displaystyle {\rm {ES}}}$:

${\displaystyle [{\mbox{E}}]_{\rm {tot}}\ {\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ [{\mbox{E}}]+[{\mbox{ES}}].}$

Representación gráfica de la curva de saturación de una enzima donde se puede observar cómo evoluciona la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción.

La ecuación de Michaelis-Menten[9] describe cómo la velocidad de la reacción depende del equilibrio entre la ${\displaystyle {\rm {[S]}}}$ y la constante ${\displaystyle k_{2}}$. Leonor Michaelis y Maud Menten demostraron que si ${\displaystyle k_{2}}$ es mucho menor que ${\displaystyle k_{1}}$ (aproximación del equilibrio) se puede deducir la siguiente ecuación:

${\displaystyle v={\frac {V_{\rm {max}}[{\mbox{S}}]}{K_{\rm {m}}+[{\mbox{S}}]}}.}$     (Ecuación 2)

Esta famosa ecuación es la base de la mayoría de las cinéticas enzimáticas de sustrato único.

La constante de Michaelis ${\displaystyle K_{\rm {m}}}$ se define como la concentración donde la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de la ${\displaystyle V_{\rm {max}}}$. Esto puede verificarse sustituyendo la concentración de sustrato por dicha constante (${\displaystyle \mathrm {[S]} =K_{\rm {m}}}$). Si la etapa limitante de la velocidad de la reacción es lenta comparada con la disociación de sustrato (${\displaystyle k_{2}\lll k_{1}}$), la constante de Michaelis ${\displaystyle K_{\rm {m}}}$ será aproximadamente la constante de disociación del complejo ${\displaystyle {\rm {ES}}}$, aunque sea una situación relativamente rara.

La situación más común, donde ${\displaystyle k_{2}>k_{1}}$, es denominada cinética de Briggs-Haldane.[10] La ecuación de Michaelis-Menten aún se mantiene bajo estas condiciones más generales, como puede derivarse de la aproximación del estado estacionario. Durante el período inicial, la velocidad de la reacción es más o menos constante, indicando que la ${\displaystyle {\rm {[ES]}}}$ también se mantendrá constante:

${\displaystyle {\frac {\mathrm {d} }{\mathrm {d} t}}[{\mbox{ES}}]=k_{1}[{\mbox{E}}][{\mbox{S}}]-k_{2}[{\mbox{ES}}]-k_{-1}[{\mbox{ES}}]\approx 0.}$

De esta forma, la concentración de ${\displaystyle {\rm {ES}}}$ viene dada por la siguiente expresión:

${\displaystyle [{\mbox{ES}}]\approx {\frac {[{\mbox{E}}]_{\rm {tot}}[{\mbox{S}}]}{[{\mbox{S}}]+K_{\rm {m}}}},}$

donde la constante de Michaelis ${\displaystyle K_{\rm {m}}}$ se define así:

${\displaystyle K_{\rm {m}}\ {\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\approx {\frac {[{\mbox{E}}][{\mbox{S}}]}{[{\mbox{ES}}]}}.}$

Con lo cual, después de operar todos los factores, obtenemos una fórmula general para la velocidad de la reacción que coincide con la ecuación de Michaelis-Menten:

${\displaystyle v=k_{2}[\mathrm {ES} ]={\frac {k_{2}[{\mbox{E}}]_{\rm {tot}}[{\mbox{S}}]}{[{\mbox{S}}]+K_{\rm {m}}}}={\frac {V_{\rm {max}}[{\mbox{S}}]}{[{\mbox{S}}]+K_{\rm {m}}}}.}$

La constante de especificidad ${\displaystyle k_{\rm {cat}}/K_{\rm {m}}}$ mide la eficiencia con la que una enzima convierte un sustrato en producto. Utilizando la definición de la constante de Michaelis ${\displaystyle K_{\rm {m}}}$, la ecuación de Michaelis-Menten podría escribirse de la siguiente forma:

${\displaystyle v=k_{2}[\mathrm {ES} ]={\frac {k_{2}}{K_{\rm {m}}}}[{\mbox{E}}][{\mbox{S}}],}$

donde ${\displaystyle {\rm {[E]}}}$ es la concentración de enzima libre. Así, la constante de especificidad se convierte en una constante bimolecular efectiva de la enzima libre que reacciona con sustrato libre para formar producto. Esta constante viene definida por la frecuencia con la que el sustrato y la enzima se encuentran en una solución, y ronda aproximadamente un valor de 10¹⁰ M^-1 s^-1 a 25 °C. Curiosamente, este máximo no depende del tamaño del sustrato o de la enzima. La proporción de las constantes de especificidad para dos sustratos es una comparación cuantitativa de la eficiencia de la enzima para convertir en productos dichos sustratos. La pendiente de la ecuación de Michaelis-Menten a bajas concentraciones de sustrato (cuando ${\displaystyle \mathrm {[S]} \ll K_{\rm {m}}}$) también proporciona la constante de especificidad.

La gráfica de Lineweaver-Burke o del doble recíproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el gradiente de la velocidad.

La gráfica de velocidad frente a ${\displaystyle {\rm {[S]}}}$ mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la concentración de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla, podía llegar a ser realmente difícil estimar los valores de la ${\displaystyle K_{\rm {m}}}$ y la ${\displaystyle V_{\rm {max}}}$ en las gráficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten, dando como resultado la gráfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente tutorial de la cinética de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia ^α, se puede simular el comportamiento de una enzima variando las constantes cinéticas.

La gráfica de Lineweaver-Burk o representación de doble recíproco es la forma más común de mostrar los datos cinéticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten:

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {K_{\rm {m}}}{V_{\rm {max}}[{\mbox{S}}]}}+{\frac {1}{V_{\rm {max}}}}.}$

Como se puede apreciar en la figura de la derecha, el resultado de este tipo de representación es una línea recta que corta al eje de ordenadas en ${\displaystyle 1/V_{\rm {max}}}$ y al de abscisas en ${\displaystyle -1/K_{\rm {m}}}$.

Obviamente, no se pueden tomar valores negativos para ${\displaystyle 1/\mathrm {[S]} }$; el mínimo valor posible es ${\displaystyle 1/\mathrm {[S]} =0}$, que correspondería a una concentración infinita de sustrato, donde ${\displaystyle 1/v=1/V_{\rm {max}}}$. El valor del punto de corte entre la recta y el eje x es una extrapolación de datos experimentales obtenidos en laboratorio. Generalmente, las gráficas de Lineweaver-Burke distorsionan las medidas realizadas a bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy exactas de la ${\displaystyle V_{\rm {max}}}$ y de la ${\displaystyle K_{\rm {m}}}$.[11] Un modelo lineal mucho más exacto es el diagrama de Eadie-Hofstee, pero en las investigaciones científicas actuales, todo este tipo de linearizaciones han quedado obsoletos y han sido sustituidos por métodos más fiables basados en análisis de regresión no lineal. Para analizar los datos es conveniente la normalización de los mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo la cantidad de trabajo experimental a realizar e incrementando la fiabilidad del análisis.[12]

La importancia del estudio de la cinética enzimática reside en dos principios básicos. En primer lugar, permite explicar cómo funciona una enzima, y en segundo lugar, permite predecir cómo se comportará esa enzima in vivo. Las constantes cinéticas definidas anteriormente, ${\displaystyle K_{\rm {m}}}$ y ${\displaystyle V_{\rm {max}}}$, son los pilares fundamentales a la hora de intentar comprender el funcionamiento de las enzimas en el control del metabolismo. Así, ${\displaystyle V_{\rm {max}}}$ se define como la velocidad máxima de una reacción con una concentración de enzima determinada (${\displaystyle V_{\rm {max}}=E_{0}k_{2}}$) y ${\displaystyle K_{\rm {m}}}$ como la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima de la reacción.

Sin embargo, llevar a cabo estas predicciones no es trivial, incluso en los sistemas más simples. Por ejemplo, la malato deshidrogenasa sintetiza, en el interior de la mitocondria, oxalacetato, el cual puede ser sustrato de diversas enzimas como la citrato sintasa, en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, en la gluconeogénesis, o la aspartato aminotransferasa, en la biosíntesis de ácido aspártico. Para ser capaz de predecir cuánto oxalacetato será desviado por cada una de las rutas es necesario saber tanto la concentración del oxalacetato como la concentración y los parámetros cinéticos de cada una de las enzimas. Este ejemplo denota la complejidad que podemos llegar a encontrar al intentar predecir el comportamiento de rutas metabólicas completas o de organismos enteros, por medio de modelos matemáticos. Aunque estos objetivos aún no se han alcanzado en eucariotas, se han obtenido ciertos progresos en bacterias, utilizando modelos del metabolismo de Escherichia coli.[13][14]

Mecanismo de complejo ternario al azar para una reacción enzimática. La enzima E une los sustratos A y B y libera los productos P y Q en un orden no definido.

Las enzimas (E) que presentan este mecanismo de reacción unen al mismo tiempo los dos sustratos (A y B), dando lugar a un complejo ternario EAB. El orden secuencial de unión de los sustratos puede ser al azar (mecanismo al azar) o seguir un orden en particular (mecanismo ordenado). Si fijamos la concentración del sustrato A y variamos la de B, y representamos gráficamente el comportamiento de la enzima mediante un diagrama de Lineweaver-Burke, obtendremos una serie de rectas con un punto de intersección común a todas ellas.

Entre las enzimas que presentan este mecanismo podemos encontrar la glutatión S-transferasa,[15] la dihidrofolato reductasa[16] y la ADN polimerasa.[17] Los siguientes enlaces muestran animaciones del mecanismo de complejo ternario de la dihidrofolato reductasa ^β y de la ADN polimerasa ^γ.

Como se puede apreciar en la figura de la derecha, las enzimas con un mecanismo de ping-pong pueden presentar dos estados, la conformación normal (E) y la conformación modificada químicamente (E*) o conformación intermedia. En este tipo de mecanismo, el sustrato A se une a la enzima E, que pasa a un estado intermedio E*, por ejemplo, por transferencia de un grupo químico al centro activo de la enzima, pudiendo ya ser liberado en forma de producto P. Únicamente cuando el sustrato A ya ha sido liberado del centro activo de la enzima puede unirse el sustrato B, que devuelve a la enzima modificada E* a su estado original E, y liberarlo en forma de producto Q. Si fijamos la concentración de A y variamos la de B, y representamos gráficamente una enzima con mecanismo de ping-pong en un diagrama de Lineweaver-Burke, obtendremos una serie de rectas paralelas entre sí.

Mecanismo de ping-pong para una reacción enzimática. La unión de los sustratos A y B tiene lugar en un orden definido y secuencial, por medio de un intermediario enzimático modificado, E*.

Entre las enzimas con este tipo de mecanismo podemos encontrar alguna oxidorreductasa, como la tiorredoxima peroxidasa,[18] transferasas, como la acil-neuraminato citidil transferasa,[19] y serin proteasas, como la tripsina y la quimiotripsina.[20] Las serin-proteasas conforman una diversa familia de enzimas muy comunes, que incluyen enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina y elastasa), varias enzimas del proceso de coagulación y muchas otras. En las serin-proteasas, el estado intermedio E* es una especie acilada en una serina del centro catalítico de la enzima. El siguiente enlace muestra una animación del mecanismo catalítico de la quimiotripsina ^δ.

Los inhibidores enzimáticos reversibles pueden ser clasificados como competitivos, acompetitivos, no competitivos y mixtos, según el efecto que produzcan en las constantes cinéticas K_m y V_max. Este efecto dependerá de que el inhibidor se una a la enzima E, al complejo enzima-sustrato ES o a ambos, como se puede observar en la figura de la derecha y en la tabla inferior. Para clasificar correctamente un inhibidor pueden llevarse a cabo estudios de su cinética enzimática en función de la concentración de inhibidor. Los cuatro tipos de inhibición dan lugar a diagramas de Lineweaver-Burke y de Eadie-Hofstee[11] que varían de diferente forma con la concentración de inhibidor. Para abreviar, se usan dos símbolos:

${\displaystyle \alpha =1+{\frac {[{\mbox{I}}]}{K_{i}}}}$      y      ${\displaystyle \alpha ^{\prime }=1+{\frac {[{\mbox{I}}]}{K_{i}^{\prime }}}}$

donde K_i y K'_i son las constantes de disociación para unirse a la enzima y al complejo enzima-sustrato, respectivamente. En presencia de un inhibidor reversible, los valores aparentes de la K_m y la V_max pasan a ser (α/α')K_m y (1/α')V_max, respectivamente, como se puede apreciar en la tabla inferior para los casos más comunes.

		Tipo de inhibición	Km aparente	Vmax aparente
solo Ki	(${\displaystyle \alpha ^{\prime }=1}$)	competitiva	${\displaystyle K_{\rm {m}}\alpha ~}$	${\displaystyle ~V_{\rm {max}}~}$
solo Ki'	(${\displaystyle \alpha =1~}$)	no competitiva	${\displaystyle {\frac {K_{\rm {m}}}{\alpha ^{\prime }}}}$	${\displaystyle {\frac {V_{\rm {max}}}{\alpha ^{\prime }}}}$
Ki = Ki'	(${\displaystyle \alpha =\alpha ^{\prime }}$)	acompetitiva	${\displaystyle ~K_{\rm {m}}~}$	${\displaystyle {\frac {V_{\rm {max}}}{\alpha ^{\prime }}}}$
Ki ≠ Ki'	(${\displaystyle \alpha \neq \alpha ^{\prime }}$)	mixta	${\displaystyle {\frac {K_{\rm {m}}\alpha }{\alpha ^{\prime }}}}$	${\displaystyle {\frac {V_{\rm {max}}}{\alpha ^{\prime }}}}$

Los ajustes por regresión no lineal de los datos de cinética enzimática[32] pueden proporcionar estimaciones muy precisas de las constantes de disociación K_i y K_i'.

Los inhibidores enzimáticos también pueden unirse e inactivar una enzima de forma irreversible, generalmente por medio de modificaciones covalentes de residuos del centro catalítico de la enzima. Estas reacciones decaen de forma exponencial y suelen ser saturables. Por debajo de los niveles de saturación, mantienen una cinética de primer orden con respecto al inhibidor.