Replicación de ADN

La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un único origen de replicación se denomina replicón o unidad funcional de replicación. El genoma bacteriano es un replicón único circular. En organismos eucarióticos, la replicación del ADN se inicia en múltiples orígenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay varios replicones.[2]

En las células eucariotas hay varios replicones.

Experimento de Cairns.

Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli permitieron determinar la existencia de ese punto fijo u origen de replicación a partir del cual el genoma empezaba a replicarse. Los experimentos consistían en mantener un cultivo de E. coli creciendo en un medio que contenía timidina tritiada (timina marcada con tritio), de forma que el ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una autorradiografía. A continuación se observaba al microscopio. Los resultados indicaban que la replicación en E. coli se iniciaba en un punto concreto (OriC).[3]

Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genéticos de complementación de mutaciones que permitieron determinar que desde los orígenes la replicación avanza de forma secuencial. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible obtener cultivos sincronizados de forma que todas las células del cultivo estuvieran en la misma fase del ciclo celular. El método consistía en la conjugación bacteriana de cepas silvestres con cepas mutantes incapaces de sintetizar determinados aminoácidos. Conociendo la localización de los genes que codifican las proteínas implicadas en la síntesis de los diferentes aminoácidos en el cromosoma bacteriano, y haciendo crecer las bacterias receptoras en un «medio mínimo» (donde solo pudiesen crecer las que hubieran recibido alguno de estos genes), al extraer ADN a diferentes tiempos se observó que, tras la última extracción aparecía con mayor frecuencia el gen implicado en la síntesis de uno de los aminoácidos (el correspondiente a la "posición 1"), que el gen adyacente implicado en la síntesis de otro aminoácido ("posición 2"). De la misma forma, el gen que ocupaba la "posición 3" aparecía con menor frecuencia que el que ocupaba la "posición 2", y así sucesivamente.

Como los primeros genes en replicarse en la bacteria donadora serían los primeros en transferirse, el experimento permitió demostrar, a partir de las frecuencias relativas de los diferentes genes en las bacterias receptoras, que la replicación sigue un orden (es secuencial).

Debido a que en la célula ambas cadenas de la doble hélice de ADN se duplican al mismo tiempo, éstas deben separarse para que cada una de ellas sirva de molde para la síntesis de una nueva cadena. Por eso, la replicación avanza con una estructura en forma de horquilla formándose una burbuja u ojo de replicación (también llamada estructura θ cuando el ADN es circular debido a la similitud entre la letra griega y la forma que adopta el cromosoma bacteriano en estados intermedios de replicación, no obstante pudiendo aparecer estructuras alternativas),[3] que avanza en dirección a la región de ADN no duplicado dejando atrás los dos moldes de ADN de cadena simple donde se está produciendo la replicación.[2]

El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayoría de los casos, es decir, a partir de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. Esto ocurre en la mayoría de los organismos, pero se dan excepciones en algunos procariontes debido a que los mecanismos de replicación que tienen lugar dependen de la propia estructura de su material hereditario (si el ADN es circular, lineal, bicatenario o monocatenario).[3] Así, en casos particulares como el ADN mitocondrial, algunos plásmidos y algunos genomas monocatenarios de fagos pequeños, la replicación se da unidireccionalmente pudiendo haber uno o dos orígenes de replicación.

Distinción entre la replicación unidireccional y la bidireccional mediante el recuento de copias de genes marcadores. O es el origen de replicación y A, B, C, D, E son genes marcadores.

En la mayoría de los casos la replicación es bidireccional.

No obstante, la replicación se puede considerar, de forma general, bidireccional.

La evidencia experimental del crecimiento bidireccional de la hebra de ADN viene dada por una técnica basada en el marcaje radiactivo del ADN usando timidina marcada con tritio. Primero se añade timidina sin marcar y luego marcada con tritio; siguiendo el rastro de tritio se observa hacia dónde se ha replicado la molécula de ADN.[3] También se puede, mediante el recuento de copias de genes marcadores, determinar si la replicación es unidireccional o bidireccional. Otras técnicas se basan en medir la distancia desde los ojos de replicación hasta los extremos de un ADN lineal (o circular convertido en lineal mediante enzimas de restricción).

Mediante consumo de ATP en dirección a la horquilla de replicación, es decir, en dirección 3' → 5' en la hebra rezagada y 5' → 3' en la hebra adelantada, la helicasa actúa rompiendo los puentes de hidrógeno que mantienen unida la doble hélice.[3] El siguiente conjunto de proteínas reclutadas son las denominadas proteínas SSB[nota 1] encargadas de la estabilización del ADN monocatenario generado por la acción de las helicasas, impidiendo así que el ADN se renaturalice o forme de nuevo la doble hélice, de manera que pueda servir de molde. Estas proteínas se unen de forma cooperativa, por lo que su unión al ADN conforme avanza la helicasa es rápida. Por otro lado, conforme las helicasas van avanzando se van generando superenrollamientos en la doble cadena de ADN por delante de la horquilla y si éstos no fueran eliminados, llegado a un punto el replisoma ya no podría seguir avanzando. Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los superenrollamientos cortando una o las dos cadenas de ADN y pasándolas a través de la rotura realizada.[2]

Enzimas que participan en la replicación de E. coli: helicasa, proteínas SSB, topoisomerasa, ARN primasa, Holoenzima ADN Pol III.

En el siguiente paso, el ADN Pol III cataliza la síntesis de las nuevas cadenas añadiendo nucleótidos sobre el molde. Esta síntesis se da bidireccionalmente desde cada origen, con dos horquillas de replicación que avanzan en sentido opuesto. Cuando el avance de dos horquillas adyacentes las lleva a encontrarse, es decir, cuando dos burbujas se tocan, se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el cromosoma ha quedado replicado.

Puesto que el ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que un ARN primasa catalice la formación de un fragmento corto específico de ARN llamado cebador, que determinará el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos. Así, durante la síntesis, en cada horquilla de replicación se van formando dos copias nuevas a partir del cebador sintetizado en cada una de las dos hebras de ADN que se separaron en la fase de iniciación, pero debido a la unidireccionalidad de la actividad polimerasa de la ADN Pol III, que solo es capaz de sintetizar en sentido 5´ → 3', la replicación solo puede ser continua en la hebra adelantada; en la hebra rezagada es discontinua, dando lugar a los fragmentos de Okazaki.

La mitad del dímero del ADN Pol III sintetiza la hebra adelantada y la otra mitad la hebra rezagada.[3] La elongación de la hebra rezagada ocurre por medio del modelo del trombón.

Hebra rezagada: síntesis de cebadores, unión de fragmentos de Okazaki y eliminación de los cebadores

Enzimas que participan en la eliminación de cebadores y unión de los fragmentos de Okazaki. El cebador de ARN está pintado en azul y el ADN que lo reemplaza en naranja.

En la hebra rezagada, cuando el ADN Pol III hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de este es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado son unidos. Una vez se han juntado todos se completa la doble hélice de ADN. La eliminación de cebadores también se da en la hebra conductora, de síntesis continua, pero debido a que en ésta hay un solo cebador es un proceso que solo tiene lugar una vez, mientras que en la hebra rezagada se dará tantas veces como fragmentos de Okazaki haya.

En la eliminación del cebador (también denominado iniciador o partidor) intervienen dos enzimas: por un lado el ADN Pol I, que va eliminando el ARN con su actividad exonucleasa 3' → 5' y simultáneamente rellenando con ADN mediante su actividad polimerasa 5' → 3' (proceso denominado nick-traslation). Al final queda rotura (o «mella») entre el extremo 3'-OH libre y el fosfato 5' de la cadena sintetizada; por último, el ADN ligasa sella esa rotura catalizando la reacción de condensación entre el grupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del nucleótido contiguo, completando el enlace fosfodiéster; para ello, es preciso hidrolizar una molécula de ATP.[2]

Nota: diversos autores difieren en las enzimas implicadas en esta etapa. Para algunos no es el propio ADN Pol I la que rellena el hueco tras eliminar el cebador, sino que lo hace el ADN Pol III (la misma que polimeriza el resto de la cadena). Del mismo modo, algunos autores siguen empleando el término ribonucleasa o (ARNasa) para referirse al ADN Pol I en esta etapa, ya que hasta hace poco se desconocía que la propia ADN Pol I tenía la capacidad exonucleasa 5' → 3, y se pensaba que esto lo realizaba otro enzima, que recibía este nombre genérico.

El final de la replicación se produce cuando al ADN polimerasa III se encuentra con una secuencia de terminación. Se produce entonces el desacople de todo el replisoma y la finalización de la replicación.